枸杞的高效液相色谱指纹图谱
卢红梅,梁逸曾
(中南大学 化学化工学院,湖南 长沙,410083)
摘要: 采用高效液相色谱-二极管阵列检测器联用仪(HPLC-DAD)对中药枸杞的甜菜碱、类胡萝卜素提取液进行了指纹图谱研究。研究结果表明:用于枸杞质量控制的液相色谱指纹图谱对提取方法具有很强的依赖性,用枸杞甜菜碱提取液的液相色谱指纹图谱对品种进行识别效果较好,而采用类胡萝卜素提取液的液相色谱指纹图谱有利于枸杞真伪的识别和共有模式的建立;此外,还提供了甜菜碱和类胡萝卜素的紫外光谱,这为定性分析以及不同样本中峰的识别提供了一定的依据。
关键词: 枸杞; 高效液相色谱; 甜菜碱; 类胡萝卜素; 指纹图谱
中图分类号:R282.5 文献标识码:A 文章编号: 1672-7207(2005)02-0248-05
High Performance Liquid Chromatography Fingerprint of Fructus Lycii
LU Hong-mei, LIANG Yi-zeng
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)
Abstract: The fingerprint of betaine and carotenoids extract of Fructus Lycii was studied using high performance liquid chromatography-diode array detector(HPLC-DAD). The results show that HPLC fingerprint for quality controlling of Fructus Lycii intensively depends on extraction method. For identifying different species of Fructus Lycii, the HPLC fingerprint of betaine extract is better than that of carotenoids extract, while the HPLC fingerprint of carotenoids extract contributes to telling true one from false one, and setting up common pattern of fingerprint of Fructus Lycii. Different ways should be chosen to deal with concrete problem in quality control of Traditional Chinese medicines. And the Ultraviolet spectra of betaine and carotenoids extract of Fructus Lycii were given, which provided basis for identifying peaks in different samples and qualitative analysis.
Key words: Fructus Lycii; HPLC; betaine; carotenoids; fingerprint
枸杞(Fructus Lycii)作为一种传统名贵中药材,在国内乃至全世界范围内得到了相当广泛的应用。现代药理学研究认为,枸杞具有提高机体免疫、抗突变、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、明目以及降低血脂和胆固醇等功能。枸杞种属70~80种[1-3],如何对其进行分辨选择,目前还没有一种科学的方法。孙素琴等将枸杞优劣的原性状鉴别大体上归纳为4点[4],但是用这种原性状鉴别枸杞子优劣的方法容易受主观影响。现在有研究者用DNA技术、细胞形态学以及红外光谱等方法来对种属进行分辨[5],但这些技术尚不成熟。
目前,人们对中药的质量控制大多是对中药诸多组分中的某个有效成分或指标性成分进行定性、定量分析,但采用这种方法并不能全面地反映中药的质量。而中药指纹图谱是对某种中药材或中成药经适当处理后,采用一定的分析手段,得到能够标示该中药材或中成药特性的色谱或光谱的图谱。中药指纹图谱有2个特点:一是通过指纹图谱的特征性,能有效鉴别样品的真伪或产地;二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的确定,能有效控制产品的质量,确保产品质量的相对一致。目前,指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。在此,作者以枸杞的主要活性成分[6]中的类胡萝卜素、甜菜碱的提取液为基础对枸杞的化学指纹图谱进行探讨。
1 实 验
1.1 仪器与试剂
主要仪器有:Agilent 1100 HPLC-DAD 系统,含在线真空脱气机、高压梯度泵、二极管阵列检测器(DAD),HP Chemstation色谱工作站。
主要试剂有:乙腈(色谱纯);二氯甲烷(色谱纯);甲醇、四氢呋喃、石油醚和碳酸镁(均为分析纯); 枸杞样本1(L Chinense Mill,我国主要的野生种,日本药典将其规定为正品枸杞)与枸杞样本2(Lycium barbarum L,我国主要生产栽培种,中国药典2000年版第1部规定其为正品枸杞),由香港浸会大学提供;枸杞样本3是银川新城区企业公司土特产分部的枸杞。
1.2 试样制备
1.2.1 甜菜碱提取液的制备
甜菜碱的提取方法见文献[7-12],取0.2 g干枸杞碾碎,加入20 mL甲醇,在室温下超声振荡30 min,以3000 r/min的速度离心3 min,将残渣用甲醇重复提取3次。减压浓缩,水溶解定容。过0.45 μm微孔滤膜,作为枸杞的甜菜碱提取液供试品。
1.2.2 类胡萝卜素提取液的制备
类胡萝卜素的提取方法见文献[13-18],取10.0 g干燥枸杞与1.0 g碳酸镁一起粉碎,加入50 mL四氢呋喃和甲醇混合液(体积比为1∶1),超声振荡15 min ,以3000 r/min的速度离心6 min,加入50 mL石油醚(沸程30~60 ℃)和50 mL饱和氯化钠溶液,静置分层,再用石油醚重复萃取2次,收集上层溶液,在35 ℃减压干燥,最后用二氯甲烷溶解定容。过0.45 μm 微孔滤膜,作为枸杞的类胡萝卜素提取液供试品。
1.3 分析方法
1.3.1 甜菜碱提取液的分析
色谱柱为Agilent Zorbax NH2相柱(其高×直径为250 mm×4.6 mm,填料粒径为5 μm);流动相为水-乙腈溶液(体积比为15∶85),流速为1.0 mL/min,等梯度洗脱,温度为20 ℃,紫外检测波长为190~380 nm,进样量为10 μL。
1.3.2 类胡萝卜素提取液的分析
色谱柱为Hypersil ODS C18柱(其高×直径为250 mm×4.0 mm,填料粒径为5 μm),流动相为乙腈-二氯甲烷溶液(体积比为60∶40),流速为1.0 mL/min, 等梯度洗脱,温度为20 ℃,紫外可见检测波长为360~780 nm,进样量为10 μL。
2 实验结果
2.1 甜菜碱提取液的指纹图谱分析
检测波长为195 nm时,3个样本的甜菜碱提取液的色谱图如图1所示。由图1可见,样本1与样本2和样本3的色谱峰差异较大,而样本2和样本3的峰基本一致,即指纹图谱的特征性一致,因此,可定性地认为样本2和样本3同属一个品种。
图 1 枸杞甜菜碱提取物的色谱图
Fig. 1 Chromatogram of betaine extract of Fructus Lycii
相对单仪器的色谱分离来说,高效液相色谱-二极管阵列检测器联用仪(HPLC-DAD)所得数据为三维数据,即数据同时包含了光谱与色谱信息。光谱能提供化学物质的大量定性信息,而色谱曲线能提供定量信息。当然,如果条件控制得好,化学物质的保留时间对化学物质的定性也是很有帮助的,但是,在指纹图谱研究中,由于样本量大,很难实现样本之间的完全无漂移或其他问题,而联用仪产生的三维数据中的光谱信息则为指纹图谱研究提供了新的信息。
图2所示为样本2的色谱流出曲线,其中包含17个峰,图3所示为甜菜碱提取物色谱峰中12个峰的紫外光谱,这为甜菜碱的定性工作提供了有利的依据。
2.2 类胡萝卜素提取液的指纹图谱分析
检测波长为456 nm时,3个枸杞样本的类胡萝卜素提取液的色谱图如图4所示。
由图4可见,3个样本的类胡萝卜素提取液的色谱图很相似,根据本实验室的中药指纹图谱相似性软件计算,其相似性大于90%。可以认为这7个峰是枸杞的共有峰和特征峰,因此,可将枸杞类胡萝卜素提取物的HPLC图作为指纹图谱进行药材真伪的鉴定。
以样本1为例,图5所示为类胡萝卜素提取液的色谱;图6所示为分离后的类胡萝卜素提取液的每个峰的紫外光谱。
图 2 甜菜碱提取液的色谱图
Fig. 2 Chromatogram of betaine extract of Fructus Lycii
图 3 甜菜碱提取液的紫外光谱
Fig. 3 UV spectra of betaine extract of Fructus Lycii
图 4 枸杞类胡萝卜素提取物的色谱图
Fig. 4 Chromatogram of carotenoids extract of Fructus Lycii
图 5 类胡萝卜素提取液的色谱图
Fig. 5 Chromatogram of carotenoids extract of Fructus Lycii
图 6 类胡萝卜素提取液的紫外光谱
Fig. 6 UV spectra of carotenoids extract of Fructus Lycii
3 讨 论
从枸杞2种提取方法所得的色谱指纹图谱来看,枸杞类胡萝卜素提取液分析所得的指纹图谱之间差异很小(见图4),说明采用这种提取方法能找出枸杞的特征性峰,为有效鉴别样品的真伪提供了一定的依据;另外,在指纹图谱研究的初级阶段,需建立药材的不同种属间药材指纹图谱共有模式。从图4可以看出,枸杞的共有峰很明显,因此,采用这种方法建立共有模式较容易。而枸杞甜菜提取液各样品的指纹图谱差异很大(见图1),它正好反映出枸杞各种属之间的差异。因此,用甜菜碱提取液对枸杞进行种属的鉴定比用类胡萝卜素提取液对枸杞进行种属鉴定更合适。由图1可看出,用甜菜碱提取液指纹图谱要建立一个枸杞指纹图谱的共有模式是非常困难的。尤其在相对样本数不多或缺乏必要的数据积累的情况下,通过建立共有模式,制定合理的相似性标准,对甜菜碱提取液进行分析,会引起相当大的误差,而采用类胡萝卜素提取液的指纹图谱相对合理。
从枸杞指纹图谱的研究来看,采用一种固定的提取方法和分析方法进行指纹图谱的研究存在一定的缺陷。因为采用不同提取方法所得到的指纹图谱可能从不同侧面反映该药材的特征,从而构成其全貌,且其中每一张指纹图谱都有其相应的特征。而1张指纹图谱一般很难反映一个药材的整体特征,不能解决研究中碰到的一系列问题。
4 结 论
a. 中药枸杞的液相色谱指纹图谱对提取方法具有很强的依赖性,用枸杞甜菜碱提取液的液相色谱指纹图谱进行品种的识别效果较好,而采用类胡萝卜素提取液的液相色谱指纹图谱有利于枸杞真伪的识别和共有模式的建立。
b. 高效液相色谱虽是一种重要的中药指纹图谱研究方法,但是在实际应用中,采用一种固定的提取和分析方法进行指纹图谱的研究,缺乏科学性。因此,在进行中药指纹图谱研究时,如何根据具体问题选择不同方法建立指纹图谱,是指纹图谱研究中必须解决的问题。
参考文献:
[1]TATSUYA F, JUN Y, HIROYOSHI O. Phylogeny and Biogeography of the Genus Lycium(Solanaceae): Inferences from Chloroplast DNA Sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2001,19(2):246-258.
[2]BERNARDELLO L, LUJN M C. Pollen Morphology of Tribe Lycieae: Grabowskia, Lycium, Phrodus(Solanaceae)[J].Review of Palaeobotany and Palynology,1997,96(3):305- 315.
[3]何进,阎淳泰,梁运祥. 枸杞果实化学成分研究概况[J]. 中国野生植物资源,1997,16(1):8-11.
HE Jin, YAN Chun-tai, LIANG Yun-xiang. A Review of Studies on Ingredient of Fructus Lycii[J]. Chinese Wild Plant Resources, 1997, 16(1):8-11.
[4]孙素琴,王米渠,梁曦云,等. 枸杞子四种原性状的FTIR光谱法鉴别[J]. 光谱学与光谱分析, 2001, 20(6): 787-789.
SUN Su-qin, WANG Mi-qu, LIANG Xi-yun, et al. A Rapid Method for the Identification of four Different Features of Gouqizi by FTIR Spectrometry[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2001, 20(6): 787-789.
[5]彭勇,孙素琴,赵中振,等. 国产枸杞属植物的红外指纹图谱无损快速鉴别研究[J].光谱学与光谱分析, 2004, 24(6): 679-681.
PENG Yong, SUN Su-qin, ZHAO Zhong-zhen, et al. A Rapid Method for Identification of Genus Lycium by FTIR Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2004, 24(6): 679-681.
[6]李忠,罗琼,张声华. 枸杞及枸杞多糖研究(Ⅱ)[J]. 食品科学,1996,17(9):9-12.
LI Zhong, LUO Qiong, ZHANG Sheng-hua. The Study in Fructus Lycii and Lycium Barbarum Polysaccharides[J]. Food Science, 1996,17(9):9-12.
[7]YOUNG G S, KYUNG H C, JONG M K, et al. Determination of Betaine in Lycium Chinense Fruits by Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 1999, 857(2):331-335.
[8]MAR H M H, RIDKY W T, GARNER C S, et al. A Method for the Determination of Betaine in Tissues Using High Performance Liquid Chromatography[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 1995, 6(7): 392-398.
[9]EICHENBERGER W, GRIBI C, GFELLER H, et al. Gas Chromatographic-mass Spectrometric Identification of Betaine Lipids in Chroomonas Salina[J]. Phytochemistry, 1996, 42 (4): 967-972.
[10]KATO M, SAKAI M, ADACHI K, et al. Distribution of Betaine Lipids in Marine Algae[J]. Phytochemistry, 1996, 42(5): 1341-1345.
[11]WOOD V K, BONHAM C C, MILES D, et al. Characterization of Betaines Using Electrospray MS/MS[J]. Phytochemistry, 2002, 59(7): 759-765.
[12]KNZLER K, EICHENBERGER W. Betaine Lipids and Zwitterionic Phospholipids in Plants and Fungi[J]. Phytochemistry, 1997, 46(5):883-892.
[13]HART J D, John K S. Development and Evaluation of an HPLC Method for the Analysis of Carotenoids in Foods, and the Measurement of the Carotenoid Content of Vegetables and Fruits Commonly Consumed in the UK[J]. Food Chemistry, 1995, 54(1):101-111.
[14]JORDI O, ANDREU P. Chromatographic Determination of Carotenoids in Foods[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 881(2): 543-555.
[15]RODRIGUEZ-AMAYA B D. Some Considerations in Generating Carotenoid Data for Food Composition Tables[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2000, 13(4): 641-647.
[16]SU Qing, ROWLEY K G, BALAZS D H N. Carotenoids: Separation Methods Applicable to Biological Samples[J]. Journal of Chromatography B, 2002, 781(2): 393-418.
[17]DAVOLI P, WEBER W S R. Identification and Quantification of Carotenoid Pigments in Aeciospores of the Daisy Rust Fungus, Puccinia Distincta[J]. Phytochemistry, 2002, 60(3): 309-313.
[18]BURNS J, FRASER D P, BRAMLEY M P. Identification and Quantification of Carotenoids, Tocopherols and Chlorophylls in Commonly Consumed Fruits and Vegetables[J]. Phytochemistry, 2003, 62(6): 939-947.
收稿日期:2004-04-26
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20235020, 20175036),湖南省自然科学基金资助项目(04JJ3081)
作者简介:卢红梅 (1976-),女,湖南溆浦人,博士研究生,从事中药指纹图谱及谱效研究
论文联系人: 卢红梅,女,博士研究生;电话: 0731-8830824;E-mail: lu_hongmei225@126.com
