盐酸头孢吡肟缓释微球的制备与工艺优化

彭东明^{1, 2}，王春燕¹，刘艳飞^{1, 3}，李永欣¹，苏小爱¹，帅海涛¹，盛毓¹

1.中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；

2.湖南中医学院 药学院，湖南 长沙，410208；

3. 中南大学 有色金属资源化学教育部重点实验室，湖南 长沙，410083)

摘要：以O-羧甲基壳聚糖(OCMC)为载体、戊二醛(GA)为交联剂，采用乳化交联法制备包覆盐酸头孢吡肟(CD)的药物缓释微球。以OCMC质量分数、CD与OCMC质量比(m(CD)/m(OCMC))、交联剂用量(V(GA)/m(OCMC))及油相乳化剂Span80质量分数为自变量，以载药量和包封率为因变量，采用星点设计-效应面法优化制备工艺，并对优化后的工艺进行验证。所得最优制备条件如下：OCMC质量分数为2.7%，m(CD)/m(OCMC)为0.665，交联剂用量V(GA)/m(OCMC)为8 mL/g，Span80质量分数为4%；在最优工艺条件下制备的微球外观圆整，平均粒径为7 μm，粒度跨距为1.52，载药量和包封率分别为(21.4±0.5)%和(42.3±0.7)%，缓释时间达到10 d以上；星点设计-效应面法预测性良好。

关键词：盐酸头孢吡肟；O-羧甲基壳聚糖；星点设计-效应面法；缓释微球

中图分类号：O636.1       文献标志码：A         文章编号：1672-7207(2013)03-0907-07

Preparation and optimization of controlled release microspheres of cefepime dihydrochloride

PENG Dongming^{1, 2}, WANG Chunyan¹, LIU Yanfei^{1, 3}, LI Yongxin¹, SU Xiaoai¹, SHUAI Haitao¹, SHENG Yu¹

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;

2. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;

3.Key Laboratory of Resources Chemistry of Nonferrous Metals,Ministry of Education,Central South University,Changsha 410083,China)

Abstract: O-carboxymethylchitosan (OCMC) microspheres containing an antibiotic drug cefepime dihydrochloride (CD) were prepared by emulsion crosslinking using glutaraldehyde (GA). The central composite design-response surface methodology was used to optimize process variables and the optimized formulation was validated. The OCMC concentration in the aqueous phase, mass ratio of CD to OCMC (m(CD)/m(OCMC)), the dosage of crosslinker (V(GA)/m(OCMC)) and the Span80 concentration in the organic phase were listed as independent variables and the dependent variables were drug-loading and encapsulation efficiency. The results show that the optimal values are as follows: the OCMC concentration is 2.7%, m(CD)/m(OCMC) is 0.665, the dosage of crosslinker (V(GA)/m(OCMC)) is 8 mL/g, the Span80 concentration is 4%. According to these conditions, the microspheres are spherical in shape. The mean diameter of the microspheres is 7 μm and the span is 1.52. The drug loading and drug encapsulation efficiency of CD-loaded microspheres are (21.4±0.5)% and (42.3±0.7)%, respectively. The microspheres are proved to be successful in prolonging drug release up to 10 d or more. The central composite design-response surface methodology has good prediction ability.

Key words: cefepime dihydrochloride; O-carboxymethylchitosan; central composite design-response surface methodology; controlled release microspheres

盐酸头孢吡肟(CD)是第四代头孢菌素，它对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有广谱抗菌性，且对革兰氏菌的抗菌活性优于第三代头孢菌素^[1]。同时，与第三代头孢菌素相比，盐酸头孢吡肟拥有更好的耐受性^[2]。但盐酸头孢吡肟的平均血浆消除半衰期只有2 h^[3]，临床上主要以增大剂量来延长给药间隔时间^[4]，这样不可避免地增加了机体内药物的血药浓度及药物对机体的毒性。尽管头孢吡肟的耐受性很好，但是，大剂量头孢吡肟仍存在毒性。有研究表明：头孢吡肟能产生神经毒素，可能会引起癫痫、紊乱、震颤、运动失调、躁动等不良反应^[3]。把药物制成缓释长效制剂，可以使血药浓度平稳，避免谷峰现象，有利于减少药物的不良反应，提高患者的依从性，减少剂量等。O-羧甲基壳聚糖(OCMC)是壳聚糖的水溶性衍生物，它继承了壳聚糖优良的生物活性，同时改善了壳聚糖的水溶性，现已被广泛应用于控释缓释体系^[5-7]。乳化交联法反应条件温和，有利于保持药物的结构和生物活性^[8]。在此，本文作者选用乳化交联法，以戊二醛(GA)为交联剂，OCMC为载体制备了盐酸头孢吡肟O-羧甲基壳聚糖(CD-OCMC)缓释微球；采用星点设计-效应面法优化了制备工艺。

1  材料与方法

1.1  材料

O-羧甲基壳聚糖(青岛海普生物技术公司生产)；25%(质量分数)戊二醛溶液(上海化学试剂公司生产)；盐酸头孢吡肟(纯度为99.8%，上海新亚化工有限公司生产，储存于温度为4 ℃的冰箱中)；其他试剂都为分析纯。

1.2  微球的制备

配制一定浓度的OCMC生理盐水溶液，常温下搅拌4 h至OCMC完全溶胀。加入一定量的CD，以转速50 r/min搅拌2 h。将上述混合均匀的溶液加入到50 mL包含一定量Span80的液体石蜡中，以转速500 r/min搅拌1 h。加入一定量的GA，交联固化2 h。砂芯漏斗抽滤，石油醚洗涤3次，丙酮洗涤3次，得浅黄色微球。在40 ℃的真空干燥箱中干燥得OCMC空白微球及CD-OCMC微球。

1.3  微球的性能及表征

采用激光粒度分布仪(MALVEN, MASTERSIZER 2000, British)测定微球的粒度分布情况；用光学显微镜(XSP-2C)及扫描电镜(SEM, JSM-6360)观察微球的形貌；对CD，OCMC，空白微球和载药微球进行红外光谱(FTIR)及X线衍射图谱(WXRD)测试。

1.4  标准曲线的绘制

精密称量10 mg CD 2份分别置于2个100 mL的容量瓶中，分别用pH=1.2的盐酸溶液、pH=7.3的磷酸缓冲溶液溶解并定容的测试液。取少测试液在200~500 nm波长范围内作紫外扫描。结果显示：2份测试液分别在257 nm及236 nm处有最强吸收。

取测试液0，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL置于25 mL的比色管中，加pH=1.2的盐酸溶液至刻度，于257 nm处测定CD标准液吸光度(A)。根据CD的浓度c和吸光度绘制标准曲线，对所得标准曲线进行线性回归，得出线性回归方程为：A=50.669 97c-0.001 05，R=0.999 94。以pH=7.3的磷酸缓冲溶液为溶剂的标准曲线回归方程为：A'=56.415 59c'-0.000 75，R=0.999 97。空白微球溶液在波长为257和236 nm处无紫外吸收峰，说明交联剂戊二醛对盐酸头孢吡肟的浓度检测无干扰。

1.5  微球载药量包封率的测定

精密称取20 mg载药微球，粉碎，加入到50 mL pH=1.2 HCl溶液中，在40 kHz超声3 h。取上清液用超滤膜(孔径为4.5 μm)过滤，使用紫外分光光度计(UV-9600)在257 nm处测定吸光度，由标准曲线计算出CD的浓度，载药量(Y₁)及包封率(Y₂)的计算公式如下：

，

式中：m₀为实际投药质量；m₁为微球中药物质量；m₂称取微球总质量。

1.6  星点设计优化制备工艺

星点设计可以同时考察几个独立变量对因变量的影响，试验次数少、精确度高、应用方便^[9-13]。在预实验的基础上，以OCMC质量分数(X₁)、CD/OCMC质量比即m(CD)/m(OCMC)(X₂)、交联剂用量(V(GA)/ m(OCMC)，X₃)及Span80质量分数(X₄)为自变量，以Y₁和Y₂为因变量设计优化实验。各因素的水平根据预实验结果和实验需要设定，见表1。实验安排与结果如表2所示。

表1  因素水平表

Table 1  Factor levels for experimental design

表2  星点设计与结果

Table 2  Central composite design and experimental results

1.7  体外释放

采用智能药物溶出仪(RCZ-8A)进行微球体外释放的性能研究。准确称取200 mg载药微球，置于透析袋中(截留相对分子质量为8 000~1 4000)，再加入5 mL pH=7.3的磷酸缓冲溶液，扎紧两端，置于转篮子中。释放液为900 mL pH=7.3的磷酸缓冲溶液。调节温度为37 ℃，转速为100 r/min，隔一定时间取5 mL释放介质，在236 nm波长处测定紫外吸光度，同时补充释放液，由标准曲线计算累积溶出率。

2  结果与讨论

2.1  红外光谱分析

图1所示为OCMC、空白微球、载药微球、CD的红外光谱图。由图1可见：OCMC的特征吸收峰为3 428 cm^-1处的O—H和N—H伸缩振动峰，1 618 cm^-1处—COO^-的反对称伸缩振动峰及N—H的伸缩振动峰，1 426 cm^-1处的—COO^-对称伸缩振动。交联后生成的空白微球新增了戊二醛的特征吸收峰(2 925 cm^-1和2 854 cm^-1处的C—CH₂—C特征峰)。CD的特征吸收峰为2 400~3 550 cm^-1处宽峰(羧酸离子，OH (H₂O)，NH₂，CH₃，CH₂和CONH等的伸缩振动)，1 773 cm^-1处β-内酰胺环的伸缩振动，1 655.8 cm^-1和1 630.5 cm^-1处C=O和C=N的伸缩振动，1 544 cm^-1和1 378 cm^-1处羧酸盐的双吸收带，1 445.5 cm^-1处CH₂的剪式振动及CH₃的不对称弯曲振动和1 046 cm^-1处=C—H面内摇摆振动。载药微球的红外吸收光谱与空白微球的基本相同，新增的峰为微球中载入药物CD的特征吸收峰。CD的特征吸收峰(1 773 cm^-1处β-内酰胺环的伸缩振动)出现在载药微球中。2 400~3 550，1 612，1 406，1 319及1 054 cm^-1处的吸收峰强度增大，这归因于CD与空白微球的特征吸收峰的重叠。说明CD被成功包覆在OCMC中。

图1  OCMC、空白微球、载药微球、CD的红外光谱图

Fig.1  FTIR spectra of OCMC, placebo microspheres, CD-loaded microspheres and pure CD

2.2  X衍射图谱分析

CD，OCMC，空白微球和载药微球的X线衍射图谱如图2所示。可见：CD是一种结晶性的物质；OCMC为低结晶度物质；与OCMC相比，空白微球的结晶度下降，2θ=32°，44°的衍射峰消失，2θ=20°的峰强度减弱；载药微球的衍射图谱与空白微球的基本相似，载药微球中没有药物的结晶峰出现，说明药物以分子水平被包覆在载体中^[14]。

图2  CD，OCMC，空白微球和载药微球的X线衍射图谱

Fig.2  XRD spectra of CD, OCMC, placebo microspheres, and CD-loaded microspheres

2.3  微球的粒度与形貌分析

图3所示为空白微球和载药微球的光学显微镜图像，可见微球外观圆整，流动性好。图4所示为载药微球的SEM图，可以看出微球为光滑的球体，粒径小于10 μm。图5所示为载药微球的粒度分布图，可见载药微球粒径为0.36~19.96 μm，平均粒径为7 μm，粒度跨距为1.52，与SEM结果基本相符。

2.4  星点设计与效应面分析

采用SAS 9.2软件，以载药量和包封率为因变量，分别对各因素进行多元线性回归及二次多项式拟合。多元线性回归方程：

Y₁=8.776+0.450X₁+10.230X₂+0.170X₃+0.128X₄

(显著性水平P=0.051 4, 相关系数R² =0.295 0,

修正的相关系数=0.186 6);

Y₂=71.359+2.706X₁-71.971X₂+0.413X₃+0.531X₄

(P＜0.000 1, R²=0.848 3,=0.825 0)。

二次多项式方程：

Y₁=-15.187+9.726X₁+69.683X₂-0.567X₃-0.848X₄-

1.528X₁²+3.370X₁X₂-70.698X₂²-0.319X₁X₃+2.377X₂X₃-

图3  空白微球与载药微球的光学显微镜图像

Fig.3  Light micrographs of placebo microspheres and CD-loaded microspheres

0.057X₃²- 0.213X₁X₄+0.119X₂X₄+0.300X₃X₄-0.119X₄²

(P＜0.000 1, R²=0.975 8, =0.954 7)；

Y₂=-55.430+5.532X₁-69.187X₂+6.207X₃+2.114X₄-

0.086X₁²+0.668X₁X₂-36.668X₂²-0.105X₁X₃+

7.031X₂X₃-0.530X₃²-0.011 8X₁X₄-7.949X₂X₄+

0.407X₃X₄-2.094X₄²

(P＜0.000 1, R²=0.968 8, =0.941 4)。

可见，二次多项式拟合效果优于多元线性回归方程。对二项式方程进行逐步回归分析，以达到简优化模型的目的^[15-16]。

简化后的二次多项式方程：

Y₁=-19.347+9.494X₁+71.813X₂-1.592X₁²+

3.370X₁X₂-71.389X₂²-0.356X₁X₃+2.272X₂X₃-

0.068X₃²+0.241X₃X₄-0.223X₄²

(P＜0.000 1, R²=0.972 2, =0.958 3);

Y₂=-65.368+54.083X₁-52.476X₂+7.836X₃+

21.442X₄-8.600X₁²-36.668X₂²-1.047X₁X₃+

7.031X₂X₃-0.530X₃²-7.949X₂X₄ -2.094X₄²

(P＜0.000 1, R²=0.963 2, =0.941 9)。

二次多项式方程简化前后回归系数的显著性水平(P)对比见表3。方程简化以后各回归系数的显著性水平明显提高。由简化后二次多项式方程的回归系数可见：各因素对载药量及包封率的影响由大到小为X₂，X₁，X₄，X₃。

图4  载药微球的SEM像

Fig.4  SEM images of CD-loaded microspheres

图5  载药微球的粒度分布

Fig.5  Particle size distribution of CD-loaded microspheres

根据简化的二次多项式方程，应用SAS 9.2软件分别绘制载药量和包封率与影响较大的2个因素X₁和X₂间的三维响应面图及等高线(其他自变量设为中点值)，见图6。由图6(a)和6(b)可见：载药量随着OCMC质量分数(X₁)的增大先增大后减小，当X₁为2.8时，载药量最大；随着m(CD)/m(OCMC)(X₂)的增加先增大后减小，当X₂达0.76左右时，载药量最大。由预实验结果可知：本实验的关键在于配制均一的水相，但提高m(CD)/m(OCMC)不利于均一水相的配制。由图6(c)和6(d)可知：包封率随着OCMC质量分数(X₁)的增大先增大后减小，当X₁为2.7左右时，包封率最高；随着m(CD)/m(OCMC)(X₂)的增大而减小，即CD/OCMC质量比越高，包封率越低。综合考虑各自变量对载药量和包封率的影响，得出最佳工艺参数为X₁=2.7，X₂=0.665，X₃=8，X₄=4。代入简化后的二次多项式方程，得载药量与包封率的预测值分别为21.1%和41.5%。

表3  回归系数的显著性水平

Table 3  Level significance of regression coefficient

图6  因素X₁和X₂的效应面与等高线图

Fig.6  Response surface plots and contour lines of X₁ and X₂

在最优工艺参数下制备3批微球，测得微球载药量为(21.4±0.5)%，包封率为(42.3±0.7)%，预测值与实测平均值的偏差分别为1.42%和1.93%。说明简化后的二次多项式方程可以很好地预测因素与指标的关系。

2.5  微球的体外释放性能

图7所示为微球在pH=7.3磷酸缓冲溶液中的释放曲线图和直线拟合图。直线拟合结果表明：其相关性好。释药模型拟合表明微球在此缓冲液中的释放符合Higuchi方程：Q_t=13.91+4.87t^1/2(其中，Q_t为不同时间的累积释放度；t为时间)。R=0.996，标准偏差S_d=2.168。

图7  载药微球的体外释放曲线及释放度与时间开方的线形图

Fig.7  Release profile of CD from CD-loaded microspheres and functional profile of square root of time and percentage of released CD

3  结论

(1) 采用乳化交联法，以戊二醛为交联剂，制备了包覆盐酸头孢吡肟的O-羧甲基壳聚糖微球。CD以分子水平被包覆在载体OCMC中。

(2) 根据星点设计，考察了OCMC水相质量分数、m(CD)/m(OCMC)、交联剂用量及油相乳化剂Span80质量分数对载药量与包封率的影响。通过多元线性拟合、二次多项式拟合、逐步回归及效应面分析，得出了最优工艺。在最优工艺条件下制备的微球为光滑的球体，平均粒径为7 μm，粒度跨距为1.52；体外释放表明其在pH=7.3的缓冲液中具有缓释作用；验证性实验表明：拟合方程能很好地预测因素与指标的关系，说明星点设计-效应面法预测性良好。

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(编辑  赵俊)

收稿日期：2012-04-17；修回日期：2012-06-20

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20090162120013)；湖南省自然科学—株洲联合基金资助项目(12JJ9046)；中南大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(2012zzts053)；国家大学生创新训练项目(AL120004)；湖南省教育厅资助项目(11C0951)

通信作者：刘艳飞(1969-)，女，湖南邵东人，博士，副教授，从事药物载体材料与制剂研究；电话：13017381167；E-mail: liuyf@ csu.edu.cn