定点突变对Procaspase-8 DEDs蛋白溶解性的影响
来源期刊：昆明理工大学学报(自然科学版)2017年第6期
论文作者：庞威威 孔庆宏 王冠林 张宽仁
文章页码：75 - 80
关键词：半胱氨酸蛋白酶-8;定点突变;诱导表达;纯化;死亡效应纤丝;
摘 要：在进行人源Procaspase-8 DEDs（也称为Caspase-8 DEDs）蛋白研究时,采用定点突变的方法对野生型（WT）Procaspase-8 DEDs蛋白编码基因的三个位点F122、L123、I128进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入表达载体p ET-28a（+）和p CMV6-AC-GFP中;在原核细胞中转化入E.Coli Transetta（DE3）,获得具有三突变（F122G/L123G/I128D）的表达菌株,当以IPTG诱导目的基因表达时,发现突变蛋白（Procaspase-8 DEDsF122G/L123G/I128D）的可溶性表达显著提高;当真核质粒转染细胞HCT116时,与野生型Procaspase-8 DEDs蛋白相比,突变型蛋白不利于死亡效应纤丝（Death Effector Filaments,DEFs）的形成.结果表明:定点突变能提高Procaspase-8DEDsF122G/L123G/I128D蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并经Ni2+蛋白纯化柱和蛋白浓缩柱作用可富集可溶性目的蛋白;同时,在真核细胞中改善了死亡效应纤丝形成问题.本文研究有助于Procaspase-8 DEDs蛋白的体外功能研究以及相关细胞系构建.
庞威威，孔庆宏，王冠林，张宽仁
昆明理工大学生命科学与技术学院
摘 要：在进行人源Procaspase-8 DEDs（也称为Caspase-8 DEDs）蛋白研究时,采用定点突变的方法对野生型（WT）Procaspase-8 DEDs蛋白编码基因的三个位点F122、L123、I128进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入表达载体p ET-28a（+）和p CMV6-AC-GFP中;在原核细胞中转化入E.Coli Transetta（DE3）,获得具有三突变（F122G/L123G/I128D）的表达菌株,当以IPTG诱导目的基因表达时,发现突变蛋白（Procaspase-8 DEDsF122G/L123G/I128D）的可溶性表达显著提高;当真核质粒转染细胞HCT116时,与野生型Procaspase-8 DEDs蛋白相比,突变型蛋白不利于死亡效应纤丝（Death Effector Filaments,DEFs）的形成.结果表明:定点突变能提高Procaspase-8DEDsF122G/L123G/I128D蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并经Ni2+蛋白纯化柱和蛋白浓缩柱作用可富集可溶性目的蛋白;同时,在真核细胞中改善了死亡效应纤丝形成问题.本文研究有助于Procaspase-8 DEDs蛋白的体外功能研究以及相关细胞系构建.
关键词：半胱氨酸蛋白酶-8;定点突变;诱导表达;纯化;死亡效应纤丝;
