DOI：10.19476/j.ysxb.1004.0609.2018.11.25
铀尾矿土壤细菌与古菌群落结构解析及耐铀菌分离鉴定
曾涛涛，李利成，陈 真，高 翔，谭文发，刘海燕，王国华
(南华大学 污染控制与资源化技术湖南省高校重点实验室，衡阳 421001)
摘 要：为了考察铀尾矿土壤中耐铀微生物群落结构，通过高通量测序技术解析细菌与古菌群落结构，并从中分离纯化耐铀菌属并进行分子生物学鉴定。通过高通量测序，分别获得42706条细菌和34346条古菌的有效序列。微生物Alpha多样性分析发现，细菌种类、群落丰富度与多样性均高于古菌的。通过细菌群落结构解析，发现Carnobacterium、Enterococcus、Comamondadaceae和Cronobacter这4类菌在铀尾矿土壤中存在，菌属丰度分别为3.14%、2.58%、0.83%和0.53%。其他优势耐铀菌为Bacillus (49.6%)、Lactococcus (31.9%)、Streptococcus (2.87%)、Caulobacter (0.89%)、Pseudomonas (0.72%)和Enterobacter (0.62%)。通过古菌群落结构解析，揭示了Candidatus Nitrosotalea(74.03%)、Methanosaeta(6.37%)、Methanobacterium(3.25%)、Crenarchaeotic(3.23%)和Terrestrial Miscellaneous(1.25%)这5类古菌在铀尾矿土壤中存在及其丰度。从铀尾矿土壤中分离出5种耐铀菌属，分子生物学鉴定发现A1和B2分别为Klebsiella sp.和Acinetobacter johnsonii菌属，而C2、D2及E2均属于Pseudomonas cedrina菌种。
关键词：铀尾矿；微生物群落；高通量测序；古菌
文章编号：1004-0609(2018)-11-2383-10 中图分类号：X172 文献标志码：A
随着中国核工业的飞速发展，对放射性铀的需求增大，对铀矿不断开采与利用造成了铀尾矿的大量积存。铀尾矿是处置铀矿石开采矿渣及其他极低放射性废渣的场所，具有放射性核素和重金属含量高、污染范围广和危害隐蔽性的特征[1]，如何安全、高效低耗进行铀尾矿污染控制与修复，成为核工业与环境保护领域的重要课题。
通过微生物修复进行铀污染控制，具有能耗低、绿色环保特点，受到研究者广泛重视[2]。目前已有较多耐辐射奇球菌[3]、硫酸盐还原菌[4]、希瓦氏菌[5]等微生物对铀进行吸附、还原的报道。然而，对铀尾矿土壤土著微生物分析[6]，并进行耐铀菌的分离[7]，是进行原位生物修复的基础。王丽超等[8]用常规微生物活性评价法和Biolog方法研究了铀尾矿区土壤微生物活性及群落功能多样性特征。与普通土壤相比，尾矿区土壤微生物活性发生了显著变化，微生物生物量和可培养细菌数量显著降低。彭芳芳等[9]采用常规稀释平板法和 Biolog-Eco 微平板方法，研究了高、中、低污染区的土壤微生物数量，发现放射性污染从高到低取样点中，微生物数量大小为细菌>真菌>放线菌。吴唯民等[10]采用基因芯片技术对美国田纳西州橡树岭铀污染地下水的功能微生物进行检测，发现与U(Ⅵ)还原有关的微生物包括脱硫弧菌、Desulfosporosinus spp.、Anaeromyxobacter spp.和土杆菌。
以上研究表明，铀尾矿中存在能够耐铀的微生物菌(群)，但国内目前尚缺少对铀尾矿土壤中细菌和古菌群落结构深入分析的报道。本文作者通过高通量测序技术，解析南方某铀尾矿土壤中细菌、古菌多样性与群落结构，并进行耐铀菌属分离，以期为铀尾矿区生物修复提供微生物学基础。
1 实验
1.1 样品采集
采样点位于我国南部某省铀尾矿处置库坝，刮去表层矿渣后，选取表层以下20 cm位置，采集500 g土壤样品。将土壤样品密封置于冰盒，立即带回实验室，在-20 ℃条件下保存备用。经检测，土壤密度为1.03~1.05 g/cm3，含水率8.2%~9.0%，土壤中铀浓度为47~60 mg/kg，远超中国土壤环境背景值2.8 mg/kg(铀矿冶辐射防护和环境保护规定GB 23727—2009)。另外，在样品中检测出镉、铜、锌、铅，这些重金属含量均超过了国家土壤环境质量二级标准。
1.2 基因组DNA提取与PCR扩增
取1 g铀尾矿土壤，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.0)清洗3次，使用OMEGA 公司 E.Z.N.A Soil DNA试剂盒提取微生物基因组DNA[11]。采用细菌16S rDNA 通用引物338F/806R进行PCR扩增V3+V4区片段[12]。使用TransStart Fastpfu DNA聚合酶(TransGen AP221-02)，20 μL反应体系，在ABI GeneAmp
9700型PCR仪上进行PCR操作。扩增程序为：95 ℃变性3 min；27个扩增循环，包括95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72℃延伸45 s三个阶段；在72 ℃终延伸10 min；最后保持在10 ℃条件待用。采用524F/Arch958R扩增古菌16S rDNA部分片段[13]，扩增循环35次，其他操作条件同细菌PCR扩增。每个样本3个重复，将PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物。
1.3 高通量测序与数据分析
通过基于Miseq PE平台(Illumina，美国)进行高通量测序。测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，根据序列之间的相似性0.97作为域值划分操作分类单元(OTU)。在Usearch软件平台(Version 7.1)进行OUT分析，绘制Rank-Abundance曲线。计算微生物Alpha多样性指数，主要包括Chao、Ace、Sobs、Shannon、Simpson和Coverage等。另外，对序列进行随机抽样，以抽到的序列数与它们所代表 OTU 的数目构建稀释曲线[14]。选用Silva数据库进行16S rRNA基因序列比对，绘制菌属丰度图。利用FastTree软件(Version 2.1.3)，选择属水平上分类信息对应的序列，根据最大似然法构建系统发育树。
1.4 耐铀菌分离及其16S rDNA鉴定
采用系列稀释法，将1 g土壤稀溶解于9 mL水中，然后分别释成1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5和1×10-6 g/mL等5个浓度，分别接种到LB固体培养基上进行平板划线。经过5代平板划线，将分离的单个菌落接种到液体培养基中，30 ℃下活化18~24 h。待菌液OD600值在1~2之间时，以10% (v/v)接种到装有10 mg/L铀的液体培养基的锥形瓶中，于转速为150 r/min、温度为30 ℃的条件下震荡培养，测定24 h后对铀的去除情况。选取除铀效果最好的5种菌，分别命名为USC A1、USC B2、USC C2、USC D2和USC E2。
按照基因组DNA提取试剂盒(北京擎科)操作说明进行细菌DNA提取，采用引物27F/ 1492R扩增16S rDNA基因，PCR扩增程序为：98 ℃变性2 min；35个扩增循环，包括98 ℃变性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s三个阶段；在72 ℃延伸10 min，最后保持在4 ℃条件待用。对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，将DNA进行割胶回收及定量检测，在ABI 3730XL测序仪测序及拼接。将5个细菌测序结果提交到Genbank，获得登录号分别为MF083942、MF083941、MF476206、MF476207和MF476208。在NCBI数据库中通过BLAST工具搜索相似序列，对所得结果通过Mega 7软件[15]，根据Neighbor-Joining 方法，比对序列1000次，并计算进化距离，构建系统发育树，完成对耐铀菌的分子生物学鉴定。
2 结果与讨论
2.1 样本序列与OTU分析
对细菌与列菌高通量测序结果进行质控，去除不符合要求的序列，分别获得42706和34346条有效序列，结果如表1所列。细菌平均序长度为449bp，其中序列长度在441~460bp之间有40171条，占总序列的94%；其他有2528条序列长度在421~440bp之间，比例约为6%。古菌平均序列长度为448bp，其中序列长度在441~460bp之间有33020条，占总序列的96%； 其他在461~480bp及481~500bp之间的序列数量分别为240与775。
表1 细菌与古菌高通量测序结果
Table 1 High-throughput sequencing results of bacteria and archaea
基于序列相似度97%划分OTU，细菌的OTU数量(145)明显多于古菌数量(20)，反映细菌种类更多。统计每个OTU所含的序列数，以此为纵坐标，以OTU等级为横坐标作图，得到Rank-Abundance曲线，如图1所示。在水平方向，曲线在横轴上的范围越大，反映物种的丰度越高；曲线趋势越平缓，说明物种分布越均匀。由图1可知，细菌的物种丰度和均匀度都比古菌要高，说明在铀尾矿中细菌是微生物的主要组成部分。
图1 细菌与古菌Rank-Abundance曲线
Fig. 1 Rank-Abundance curve of bacteria (a) and archaea (b)
2.2 微生物Alpha多样性分析
计算不同随机抽样下的Alpha多样性指数，结果如表2所列。Coverage代表取样深度，细菌Coverage为0.99955，古菌为1，反映样本中序列没有被测出的概率极低，非常好地代表样本的真实情况。Ace、Chao和Sobs指数均反映群落丰富度，且与数值大小正相关。从表2可知，细菌的Ace、Chao和Sobs明显高于古菌的，反映细菌群落丰富度要高很多。Shannon指数和Simpson指数均可以反映微生物群落多样性，多样性大小与Shannon指数数值正相关，但与Simpson指数负相关。从表2可知，细菌的Shannon较大，Simpson指数较小，反映铀尾矿中细菌多样性高于古菌。
样本中随机抽取序列数为横坐标，分别以相应的Ace、Chao和Sobs指数为纵坐标，绘制出丰富度稀疏分析图；分别以相应的OTU、Shannon和Simpson指数为纵坐标，绘制多样性稀疏分析图，结果如图2所示。不管是细菌还是古菌，丰富度稀疏曲线很快趋向平坦，说明取样的数量合理，能很好地反映取样深度。
图2 细菌与古菌Alpha多样性分析图
Fig. 2 Alpha diversity charts of bacteria (a) and archaea (b)
表2 微生物Alpha多样性统计表
Table 2 Alpha index of microbial diversity
多样性稀疏分析图中序列数量达到或接近饱和，表明本实验所得的细菌与古菌序列信息能全面地反映微生物多样性。
2.3 细菌与古菌群落结构解析
细菌和古菌在属(genus)水平各物种丰度及对应序列数量及如图3所示，对于所占比例小于0.5%的物种统计总比例，用“Other”表示。从图3(a)可知，细菌菌属比例由大到小分别为Bacillus (49.6%)、Lactococcus (31.9%)、Carnobacterium (3.14%)、Streptococcus (2.87%)、Enterococcus (2.58%)、Caulobacter (0.89%)、Comamondadaceae (0.83%)、Pseudomonas (0.72%)、Enterobacter (0.62%)和Cronobacter (0.53%)。Others比例为5.62%，未知序列(unclassified)比例为0.69%。
图3 Genus水平上细菌与古菌物种丰度图
Fig. 3 Abundance of microbial species of bacteria (a) and archaea (b) in genus level
Bacillus(枯草芽孢杆菌)是铀尾矿土壤中所占比例最大的细菌，接近细菌总数的一半，已有报道发现它具有良好的耐铀能力与铀富集效果，如马佳林等[16]研究发现其对铀的吸附量可达512.5 mg/g(干重)，吸附过程符合适合Freundlich模型；司慧等[17]研究发现，初始铀浓度为 25~100 mg/L时，枯草芽孢杆菌可正常生长，并且对铀具有富集能力，主要富集部位为细胞壁，约占菌体总吸附量的89%。Lactococcus(乳球菌)是铀尾矿土壤中所占比例第二的细菌，接近细菌总数的三分之一。OBEID等[18]研究发现，在铀浓度为10~150 μmol/L时，此类菌细胞内的谷胱甘肽能够显著降低铀毒性，解毒机制是谷胱甘肽中的羧基与U(Ⅵ)螯合形成不溶性的复合物。
Streptococcus(链球菌)是土壤中另一类优势菌，所占比例为2.87%。MISHRA等[19]将Streptococcus lactis结合到纳米颗粒上，进行U(Ⅵ)的吸附研究。结果发现，铀的吸附量与吸附剂形状有关联，喷雾干燥的圆环状形态结构可获得最大吸附量。10 min内总摄取量超过85%±2%，在pH5.0和温度25 ℃时，U(VI)的最大吸附容量(qmax)为169.5 mg/g。Caulobacter 菌属所占比例为0.89%，此前BRZOSKA等[20]从铀污染酸性沉积物中分离得到Caulobacter sp. OR37，与其他3种微生物按等比例混合，在200 μmol/L含铀培养基中，经过30周培养，此类微生物仍然为优势菌种，显示出良好的耐铀能力。
Pseudomonas(假单胞菌)所占比例为0.72%，许多研究发现Pseudomonas对铀具有很高的吸附效果与耐受能力[21]。庞园涛等[22]对十红滩铀矿中假单胞菌多样性进行研究，结果表明经过生理生化实验及16S rDNA基因序列鉴定，其中可培养的假单胞菌主要为Pseudomonas stutzeri和Pseudomonas putida，而PCR-DGGE显示Pseudomonas stutzeri是该矿床中的优势假单胞菌。Enterobacter(肠杆菌属)所占比例为0.62%。该菌属曾在铀尾矿库中出现[23]，其能够产生胞外多聚物，可有效降低铀毒性[24]，对其他重金属也具有良好的耐受能力[25]。
此外还有4种菌，Carnobacterium、Enterococcus、Comamondadaceae和Cronobacter，它们此前没有在含铀环境中的报道。Carnobacterium属于肉食杆菌属，革兰氏阳性无芽孢。 Enterococcus为肠球菌属，革兰氏阳性，细胞球形或卵圆形，兼性厌氧微生物。Comamondadaceae和Cronobacter文献报道较少。本文通过高通量测序技术，发现了此前从未在铀尾矿中报道的菌属，验证了高通量测序是一种能够有效检测微生物多样性的分子生物学技术，可以深度挖掘非培养菌属信息。
从图3(b)可知，古菌菌属组成较简单，按比例由大到小分别为Candidatus Nitrosotalea (74.03%)、Methanosaeta (6.37%)、Methanobacterium (3.25%)、Crenarchaeotic (3.23%)和Terrestrial Miscellaneous (1.25%)。另外未知序列比例之和为11.29% (unclassified)，others(单个菌属比例小于0.5%的物种统计)比例为0.58%。Candidatus Nitrosotalea为候选硝化古菌，周志成等[26]研究不同施肥方式对红壤蔬菜田氨氧化细菌和氨氧化古菌群落的影响时，曾发现此类菌存在，在土壤氨氧化过程中起着重要的作用。Methanosaeta为甲烷鬃菌，SOMENAHALLY等[27]在研究Cr(Ⅵ)对微生物群落结构影响中发现此类菌的存在，但在高Cr(Ⅵ)浓度下，甲烷古菌受到抑制。Methanobacterium为甲烷杆菌，易敏等[28]研究了处理造纸废水的颗粒污泥菌群结构特性，发现颗粒污泥中Cr(32.3 mg/kg)、Mn(1850.2 mg/kg)、As(95.1 mg/kg)和Zn(761.8 mg/kg)含量很高时，Methanobacterium古菌丰度可达4.68%，显示出较强的耐受重金属毒性能力。Crenarchaeotic为泉古菌，它和Terrestrial Miscellaneous通常在海洋沉积物中出现[29]。
此前尚未有以上古菌在铀尾矿土壤中的报道，而本实验发现它们能在铀辐射环境中生存。古菌的细胞结构与细菌显著不同，由于独特的生理特性，绝大多数的古菌都无法在实验室中纯化培养。因此，对于其在铀环境中的生态功能与耐铀机理，后续需要通过环境基因组或基因芯片检测技术深入分析。
2.4 细菌与古菌系统发育树分析
对菌属所占比例高于0.5%的细菌与古菌，分别构建系统发育树，结果如图4所示，其中各菌属所包含的序列数量可参考比例尺。同一分支代表亲缘关系较近，不同分支则同源性相对较低。由图4(a)可知，细菌的系统发育树可分成两大支，代表铀尾矿土壤中优势菌属可以分成两大簇。Caulobacter、Comamondadaceae、Pseudomonas、Enterobacter和Cronobacter为同一簇，它们之间亲缘关系较近，而这5种菌所占比例都不高，在0.53%到0.89%之间。其中，Enterobacter和Cronobacter在更细小的分支上，代表它们之间亲缘关系更近。
另外一大簇包含Bacillus、Lactococcus、Carnobacterium、Streptococcus 和Enterococcus，它们所占比例较大，从49.6%到2.58%不等，在铀尾矿土壤中优势明显。其中，Lactococcus和Streptococcus在同一个细小分支上，代表它们的亲缘关系更近。同样地，Carnobacterium和Enterococcus亲缘关系也很近。
古菌的系统发育树也分成两大支，其中Candidatus Nitrosotalea、Crenarchaeotic和Terrestrial Miscellaneous为一簇，亲缘关系较近，它们比例之和为78.78%。而Methanosaeta和Methanobacterium为同一簇，因为它们都是甲烷菌，所以亲缘关系接近，它们比例之和为9.62%。与细菌相比，古菌的系统发育树也更简单。
2.5 耐铀菌分离、鉴定
将分离获得的5个耐铀菌属USC A1、USC B2、USC C2、USC D2和USC E2，接种到10 mg/L含铀液体培养基中，考察24 h内铀的去除情况。结果发现这5种菌对铀的去除率最高分别可达到99.0%、94.7%、96.2%、99.3%和94.7%，显示出高效除铀效果，表明它们具有良好的铀尾矿原位修复潜力。将这5种细菌的16S rDNA，通过Blast工具搜索相似序列，结果如表3所列。
图4 基于高通量测序结果的铀尾矿细菌与古菌系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic trees of bacteria (a) and archaea (b) in uranium tailings based on high through-put sequencing
表3 耐铀菌16S rDNA序列相似性分析
Table 3 Similarity analysis of uranium-resistant bacterial 16S rDNA sequences
图5 根据 16S rDNA 构建的系统发育树
Fig. 5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA
USC A1、USC B2分别与Klebsiella sp. NCCP-141(AB558500.1)和Acinetobacter johnsonii strain SP171(JN409466.1)最相似，相似度均为99%；USC C2和USC D2均与Pseudomonas cedrina strain Y37(JX113244.1)最相似，相似度为99%；USC E2与Pseudomonas cedrina strain-Y310(JX113239.1)最相似，相似度为99%。由此可知，USC A1和USC B2分别为Klebsiella sp.和Acinetobacter johnsonii菌属，而USC C2、USC D2及USC E2可认为均属于Pseudomonas cedrina菌种。
将5种菌及其相似菌属序列，通过Mega 7软件构建系统发育树，结果如图5所示。从系统发育树结果可知，USC A1、USC C2、USC D2和USC E2在同一分支上，形成一组，它们的进化关系较近。而USC B2与其他4种耐铀菌不在同一分支上面，进化关系较远。A1和B2代表的菌属，在2.3部分细菌群落结构分析时，并没有出现，表面这2种菌原来在铀尾矿土壤中所占比例低于0.5%。
Klebsiella sp.为克雷伯氏菌属，属于固氮菌，庞园涛等[30]曾在十红滩铀矿床地下水与矿石中分离得到此类细菌，它们与元素N的循环密切相关。Acinetobacter johnsonii属于不动杆菌属，ISLAM等[31]研究了深地层铀矿细菌多样性、金属抗性与固铀能力，分离获得Acinetobacter菌属，发现它对Ni、Zn、Cu和Hg具有良好的抗性，且有较高的固铀能力，在48 h内除铀能力达到50 mg/g细胞干重。Pseudomonas cedrina属于假单胞菌，目前已有许多报道发现它们具有良好的铀去除能力[21-22]。
3 结论
1) 细菌与古菌高通量测序，分别获得42706和34346条有效序列。细菌的OTU数量(145)明显多于古菌(20)，细菌的Ace、Chao和Sobs指数也明显高于古菌，反映细菌种类及群落丰富度要高很多。从Shannon与Simpson指数可知，铀尾矿中细菌群落多样性也高于古菌。
2) 耐铀细菌菌属比例由大到小分别为Bacillus (49.6%)、Lactococcus (31.9%)、Carnobacterium (3.14%)、Streptococcus (2.87%)、Enterococcus (2.58%)、Caulobacter (0.89%)、Comamondadaceae (0.83%)、Pseudomonas (0.72%)、Enterobacter (0.62%)和Cronobacter (0.53%)。Carnobacterium、Enterococcus、Comamondadaceae和Cronobacter为首次发现在铀尾矿土壤中存在。
3) 古菌菌属种类较简单，按比例由大到小分别为Candidatus Nitrosotalea (74.03%)、Methanosaeta (6.37%)、Methanobacterium (3.25%)、Crenarchaeotic (3.23%)和Terrestrial Miscellaneous (1.25%)。此前尚未有以上古菌在铀尾矿土壤中的报道，其生态功能与耐铀机理有待后续研究。
4) 从铀尾矿土壤中分离出5种耐铀菌属，USC A1和USC B2分别为Klebsiella sp.和Acinetobacter johnsonii菌属，而USC C2、USC D2及USC E2均属于Pseudomonas cedrina菌种。它们在24 h内，对10 mg/L铀的去除率最高分别可达到99.0%、94.7%、96.2%、99.3%和94.7%，显示出高效除铀效果，表明它们具有良好的铀尾矿原位修复潜力。
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Microbial community of bacteria and archaea analysis in uranium tailing and uranium-resistant bacteria isolation
ZENG Tao-tao, LI Li-cheng, CHEN Zhen, GAO Xiang, TAN Wen-fa, LIU Hai-yan, WANG Guo-hua
(Hunan Province Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse Technology, University of South China, Hengyang 421001, China)
Abstract: In order to investigate the uranium-resistant microbial communities in uranium tailings, high-throughput sequencing technique was used to analyze the community structure of bacteria and archaea. And isolation and identification of uranium-resistant bacteria were carried out. The results show that, after high-throughput sequencing, sequences of 42706 and 34346 are available for bacteria and archaea with high quality, respectively. Microbial alpha diversity analysis reveals that there are much higher microbial diversity, abundance and richness of bacteria than that of archaea. According to microbial community analysis of bacteria, it is the first report of Carnobacterium, Enterococcus, Comamondadaceae and Cronobacter in uranium tailings, which occupy 3.14%, 2.58%, 0.83% and 0.53% of the bacterial abundance, respectively. It also reveals other dominant uranium-resistant bacteria of Bacillus (49.6%), Lactococcus (31.9%), Streptococcus (2.87%), Caulobacter (0.89%), Pseudomonas (0.72%) and Enterobacter (0.62%). Besides that, according to microbial community analysis of archaea, it is the first time to show the dominant archaea genus of Candidatus Nitrosotalea (74.03%), Methanosaeta (6.37%), Methanobacterium (3.25%), Crenarchaeotic (3.23%) and Terrestrial Miscellaneous (1.25%) are available in the uranium tailings with certain abundance. In addition, five uranium-resistant bacterial genera are isolated, and molecular technique identification shows A1 and B2 are similarity with Klebsiella sp. and Acinetobacter johnsonii, respectively. And C2, D2 and E2 belong to the species of Pseudomonas cedrina.
Keywords：uranium tailings; microbial community; high-throughput sequencing; archaea
Foundation item: Project(51408293) supported by the National Natural Science Foundation of China; Project (2013XQD10) supported by the Scientific Research Staring Foundation for Doctoral Program in University of South China; Project (CX2017B535) supported by the Graduate Scientific Innovation Research Project of Hunan Province, China
Received date: 2017-08-24; Accepted date: 2017-11-05
Corresponding author: ZENG Tao-tao; Tel: +86-734-8282312; E-mail: biowater@126.com
(编辑 何学锋)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51408293)；南华大学博士科研启动基金资助项目(2013XQD10)；湖南省研究生科研创新项目(CX2017B535)
收稿日期：2017-03-24；修订日期：2017-11-05
通信作者：曾涛涛，副教授，博士；电话：0734-8282312；E-mail: biowater@126.com
