“钾”细菌浸出富钾火成岩及细菌群落结构的变化

孙德四，张贤珍，肖国光

(九江学院 化学与环境工程学院，江西 九江，332005)

摘要：采用摇瓶浸出与连续浸出2种方式，研究3株“钾”细菌(胶质芽孢杆菌，即Bacillus mucilaginosus，简称BMN；环状芽孢杆菌，即Bacillus circulans，简称BCM；根瘤菌，即Rhizobium spp.，简称RHJ07)对富钾火成岩的单一与混合菌浸出效果，并对浸矿过程中混合菌群落结构的动态变化进行分析。研究结果表明：混合“钾”细菌对富钾火成岩中K，Si和Al的浸出率明显要高于各单一“钾”细菌的浸出率；与摇瓶浸出方式相比，连续浸出方式可以显著促进“钾”细菌对富钾火成岩的风化分解，混合“钾”细菌CMR对富钾火成岩中的K₂O，SiO₂和Al₂O₃的浸出率分别到达52.36%，33.62%和40.55%，而在摇瓶浸出方式中，对应的浸出率分别为30.67%，21.49%和9.91%；在富钾火成岩混合菌浸出前期，没有明显的优势菌种；浸矿中期，BCM与BMN同为优势菌种，而到浸矿后期，Bacillus mucilaginosus BMN 在群落中的比例显著上升，并最后取代Bacillus circulans BCM和Rhizobium spp.RHJ07成为优势菌种。

关键词：“钾”细菌；富钾火成岩；生物浸出；微生物群落结构

中图分类号：Q939；TD952.5             文献标志码：A         文章编号：1672-7207(2014)09-2941-11

Bioleaching of rich-potassium igneous rock by potassium-solubilizing culture and change of bacterial community structure during leaching process

SUN Desi, ZHANG Xianzhen, XIAO Guoguang

(School of Chemistry and Environmental Engineering, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China)

Abstract: Single bioleaching (Bacillus mucilaginosus BMN, Bacillus circulans BCM, Rhizobium spp. RHJ07) and a cooperative bioleaching (Bacillus mucilaginosus BMN, Bacillus circulans BCM and Rhizobium spp. HJ07) of rich-potassium igneous rock were investigated by using two bioleaching technologies of flask leaching and continuous leaching. The change of bacterial community structure during bioleaching process was analysed by bacterial identification of representative phenotypic and physiological and biochemical characteristics. The results show that the leaching rate of potassium, silicon and aluminum extraction rate from rich-potassium igneous rock by mixed culture (CMR) is higher than that by single culture. The continuous bioleaching process can promote much more remarkably potassium-solubilizing bacteria to decompose rich-potassium igneous rock in comparison with the flask bioleaching. The extraction rates of K₂O, SiO₂ and Al₂O₃ are 52.36%, 33.62% and 40.55% respectively in continuous bioleaching process, but only 30.67%, 21.49% and 9.91% respectively in flask bioleaching by mixed culture CMR. There is no obvious dominant culture in bacterial community at the early bioleaching stage, in comparison with the ratio change of the tested three potassium-solubilizing bacteria, whereas, Bacillus mucilaginosus with Bacillus circulans together is dominant at the medium-term stage of leaching, and Bacillus mucilaginosus thrives at latter stage and turns into the dominant culture in replacement of Rhizobium spp. and Bacillus circulans.

Key words: potassium-solubilizing bacteria; rich potassium igneous rock ; bioleaching; microbial community structure

钾是农作物生长的重要元素。耕层土壤作为一个天然钾库，蕴藏着很多含钾资源，但绝大部分是水难溶性的或不溶性的，不能直接被植物吸收利用。我国钾肥生产量只占世界的0.34%，除青海、新疆外，几乎没有具规模的生产基地，而消耗量占世界的14.7%，可见我国的活性钾非常短缺，主要依赖进口^[1-2]。至今，国内外主要采用高能耗、高污染的的物理化学方法从含钾矿物中提取钾，鲜见有关使用微生物技术提取钾的实验研究或工业应用的相关报道^[3]。与传统物理与化学工艺相比，生物浸出具有工艺简单、成本低、环境友好及除杂选择性好等优点^[4]，因此，开发环境友好的含钾矿物的生物提钾技术对发展生态与经济农业具有十分重要的意义。土壤中的不溶性钾主要赋存于钾长石、伊利石、明矾石和云母等硅酸盐矿物中，目前有关利用微生物风化分解这类硅酸盐矿物的研究报道较多，主要集中于天然硅酸盐矿物元素转变过程中微生物所起的作用以及矿物分解的微生物效应。已有研究表明：由于K，Fe和P等是微生物所需的生命元素，因此，自然界中各类微生物均对含有这些元素的硅酸盐矿物具有一定的风化分解能力，但具有高效分解硅酸盐矿物并能大量释放其中的有价金属元素(K，Si和Al)的微生物种类较少^[5]。通过对比已报道的含钾硅酸盐矿物微生物浸出的实验结果可知：有较强的矿物风化分解能力且对K，Si和Al具有一定溶释效果的微生物均为异养菌(主要是细菌及真菌)。其中，细菌中的胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus与环状芽孢杆菌Bacillus circulans(又称“钾”细菌或硅酸盐细菌)对硅酸盐矿物的分解能力最强；真菌中的菌根真菌Piloderma sp.、岩生真菌Rock-eating fungi及黑曲霉Aspergillus niger等对矿物中的不溶性钾、硅、铝具有较强的活化作用，但效果不如“钾”细菌。Lian等^[6]综述报道了Grudev和Genchev等利用不同来源的7株Bacillus circulans和28株fungi 浸出高岭石与伊利石的研究结果，发现摇瓶浸出30 d后，不同来源的菌种的浸矿效果存在显著的差异，Bacillus circulans最高可浸出矿物中＞40%的Al₂O₃，而fungi对Al₂O₃的浸出率最高只有30% 左右；而Aleksandrov等研究发现，利用硅酸盐细菌摇瓶浸出黑云母等含钾硅酸盐矿物，连续浸出40 d，K，Si和Al 的浸出率最高分别只有10.22%，9.24% 与9.24%，且矿物的溶蚀及金属的浸出主要发生在浸出的前5 d，但若定期(每隔5 d)更换或补充新鲜培养液6~8次，则SiO₂，Al₂O₃和K₂O的浸出率分别可达到50.28%，57.83%和51.74%。近年来，Lian等^[6-8]分别采用不同来源的野生与诱变的硅酸盐细菌及真菌摇瓶浸出铝硅酸盐矿物，K，Si和Al各金属元素的浸出率与上述结果基本一致。微生物对硅酸盐矿物的风化机理研究表明，不同来源异养菌之所以对矿物的分解能力不同，是由于它们的生长代谢差异所致；微生物主要通过有机酸的酸解、胞外聚合物的络解、生物膜及氧化还原等多种因素的协同作用方式风化分解硅酸盐矿物；微生物代谢产酸、产胞外聚合物及氧化还原酶的能力是影响其对矿物分解效果的关键因素^[9]。然而，用于解钾的微生物菌种主要用于制备生物菌肥，还鲜见有关利用微生物浸出含钾矿物提取活性钾、硅的实验研究及相关工业应用的报道。目前，硅酸盐矿物的生物浸出均采用摇瓶浸出形式，很少有关利用连续浸出方式浸出钾矿物的报道。浸矿过程中细菌的活性是影响细菌浸矿效果的关键因素。有关硫化矿生物浸出实验结果表明^[10-12]：微生物在摇瓶浸出过程中存在明显的生长延迟期、较短的对数生长期；而在分批搅拌浸出与连续浸出体系中的微生物对数生长期明显延长，特别是在连续浸出体系中细菌没有明显的生长延迟期，整个浸出过程中细菌均保持较高的活性，因而，在合适的条件下具有较高的浸矿效率。对比分析单一与混合菌浸出硫化矿效果可知：混合菌的浸矿效果明显要比单一菌的好，各菌种在浸矿过程中具有显著的协同效应^[13-14]。但至今尚无有关利用混合“钾”细菌浸出钾矿物中K，Si，Al及钾矿物浸矿过程中“钾”细菌群落结构变化的研究报道。而有关硅酸盐矿物的微生物风化分解的大量实验结果表明：不同类型菌种对矿物的分解方式存在一定的差异^{[9, 15-17]}：氧化亚铁硫杆菌可通过氧化作用风化分解硅酸盐矿物，环状芽孢杆菌对矿物中的铁具有较好的还原作用，胶质芽孢杆菌主要通过酸解、络解与絮凝分散作用释放矿物中的 K，Si和Al，而真菌可以通过菌丝生长所产生的机械力作用破坏矿物晶体结构。因此，各“硅酸盐”细菌是否浸矿过程中具有协同作用，浸矿过程中微生物群落结构如何变化等是值得研究和探索的新课题。为此，本文选用3株表型形态及生理生化特征具有较大差异的“钾”细菌，采用单一与混合菌对富钾火成岩进行摇瓶浸出与连续浸出，通过测定不同浸出上清液中的细菌浓度、pH、黏度及K，Si和Al含量，对比分析摇瓶浸出与连续浸出对细菌生长代谢及K，Si和Al溶出效率的影响。通过分析浸矿效果最好的连续浸出体系中混合菌的群落结构的演替规律，了解各菌种在浸矿过程中的地位与作用。

1  实验

1.1  实验矿样

实验用富钾火成岩样品购自浙江大学地质标本厂，样品产地为安徽寿县，呈浅褐色，斑状结构。根据X线衍射分析，其主要矿物组成为(质量分数)：钾长石66.12%；绢云母4.28%；碱性辉石7.21%；绿泥石6.09%；白榴石6.54%；钾霞石9.51%。样品的化学组成分析结果见表1。

表1  富钾火成岩的主要化学成分及质量分数

Table 1  Main chemical components in rich potassium igneous rock and their relative percentage        %

1.2  菌种及培养条件

实验中使用的3株“钾”细菌包括：胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus，简称BMN)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans，简称BCM)、根瘤菌(Rhizobium spp.，简称RHJ07)。前2株菌种购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，并通过亚硝酸钠诱变所得的突变菌株，后一个菌种由本实验室从河南铝土矿样中分离得到。混合菌株(BMN+BCM+RHJ07)用CMR表示。3株菌均用Asby^,s基质矿物培养基(即硅酸盐细菌培养基)进行活化与传代培养。

1.3  富钾火成岩浸出实验

实验采用了摇瓶浸出与连续浸出2种浸出方式。

1.3.1  摇瓶浸出实验

浸出实验采用 500 mL 的锥形瓶作为容器，瓶内装入200 mL 灭菌的硅酸盐细菌培养基，加入粒度为75 μm 的富钾火成岩，使矿浆浓度为5%，接入对数生长期的各单一“钾”细菌，混合菌 CMR按各单一菌等量(1.4×10⁷个/mL)接入锥形瓶中，使培养基中细菌初始浓度为4.2×10⁷个/mL。在初始 pH为7.2，温度为35 ℃，摇床转速为 240 r/min的条件下进行浸出培养，每个实验均设3个平行组，并设无菌空白对照实验(纯培养基浸出实验)。每隔1 d取样测定浸出液中的SiO₂、Al₂O₃、K₂O的浓度、pH、黏度与细菌浓度，取样后用新鲜培养基补足损失的浸出液。

1.3.2  连续浸出实验

为保证连续浸出环境与摇瓶浸出及分批浸出的环境基本一致，连续浸出实验在由自制的3个容器(每个容量500 mL，均有搅拌器搅动)构成的浸出装置中进行。首先将矿浆浓度为5%(粒度为75 μm)的富钾火成岩矿粉培养基溶液分别加入到3个容器中，使3个容器的初始装液量均为150 mL。然后继续在第1个容器中加入同样配置的矿粉培养基溶液，至200 mL后产生溢流，其溢流进入下一个容器，依次类推。溢流稳定后，将各单一菌及混合菌按照摇瓶浸出中的方法分别接入3个容器中，这样可使3个浸出容器中的浸出环境基本一致。在浸出过程中，从最后容器流出的矿浆每天过滤，滤液返回到第1个容器，使细菌循环使用。同时用新鲜培养基补充由于过滤与取样损失的水分。浸出周期为15 d，每隔1 d分别从3个容器中取样1 mL，分别测定其 SiO₂，Al₂O₃和K₂O浓度以及细菌浓度，取3个容器样的平均值。

1.4  物理化学分析

浸出液及浸渣中的硅(以SiO₂计量)采用硅钼蓝分光光度法(上海光谱公司，721E分光光度仪)测定；浸渣中的铝(以Al₂O₃计量)采用铬青天S 分光光度法测定；浸出液及浸渣中的钾(以K₂O计量)采用四苯硼钠分光光度法测定；pH用PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器厂)测定；浸矿上清液的黏度用黏度计测定，仪器型号为NDJ-5(上海天平厂)；培养液及浸矿上清液中的细菌数量在XS-212生物显微镜(南京江南永新光学仪器)下用平板计数法测定；用SEM(TESCAN公司，型号为VEGIILSU)与XRD(日本Rigaku 生产的D/Max-2500型X线衍射仪)观察细菌浸出前后矿样的表面微观形态及矿物组成变化；浸出液红外光谱结构采用红外光谱仪(Nicolet-360 FT-IR)在4 000~500 cm^-1区域内进行红外光谱扫描，分析不同浸出体系中浸出液的红外结构差异。

1.5  浸矿过程中混合菌CMR的群落结构分析

在各细菌生理生化及表形特征相似的情况下，浸矿过程中混合菌群落的动态演替规律一般采用16S rDNA 的克隆和限制性长度多态性分析(RFLP)手段进行确定。而本实验所使用的3株“钾”细菌的部分生理生化特征、表形特征及 DNA分子碱基中的G+C摩尔分数存在明显的差异(结果见表2)，因此，浸矿过程中“钾”细菌群落的动态演替是通过分析细菌生理生化特征、表形特征及DNA分子碱基中的G+C摩尔分数来确定的，这种方法较RFLP更加简单、直接且成本较低。实验选用混合菌CMR连续浸出体系作为研究对象，按照不同时间段从浸出液中取样1 mL，然后进行梯度稀释并涂布于含固体硅酸盐细菌培养基的平板上，静置培养直至长出菌落，随机挑选200个菌落进行分析鉴定。3株菌的生理生化特性与表型形态特征采用文献[1-2]的常规方法进行；各细菌的DNA采用上海生工生物技术有限公司提供的SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌发酵液中的DNA，采用热变性温度法来测定DNA中G+C摩尔分数。

表2  3株实验“硅酸盐”细菌的差异性特征

Table 2  Different characteristics of tested three silicate bacterial strains

2  结果与讨论

2.1  实验菌株的生理生化特性

使用硅酸盐细菌发酵培养基对细菌进行培养，在初始细菌浓度为4.2×10⁷个/mL 的条件下，测定pH和温度对BMN，BCM和RHJ07生长的影响，结果见表3和表4。由表可见，3株菌在pH为5.0~9.1和温度为25~35 ℃的范围内都能生长；最佳pH范围为7.2~8.3，最适温度范围为28~30 ℃；BMN生长的最佳pH为7.2，最适温度为35 ℃；BCM生长的最适pH和温度分别为8.3与30 ℃；RHJ07生长的最适pH和温度分别为7.2和30 ℃。尽管3株“钾”细菌的最佳pH和最适温度的差别不大，但根据前期浸矿实验结果，BMN的浸矿效果明显要比BCM和RHJ07的好，在浸矿中起主要作用，所以，在组合菌种的浸矿实验中取pH=7.2，温度为35 ℃。

表3  pH对BMN，BCM和RHJ07生长的影响

Table 3  Effect of pH value on growth of BMN, BCM and RHJ07

表4  温度对BMN，BCM和RHJ07生长的影响

Table 4  Effect of temperature on growth of BMN, BCM and RHJ07

在3株实验用“钾”细菌的最适宜生长条件下，利用含富钾火成岩矿物的硅酸盐细菌培养基对它们进行培养，测定各细菌的生长曲线及发酵液中pH与黏度随发酵时间的变化规律，结果如图1所示。从图1(a)可见：BMN菌的生长速度明显要比其他2株菌的快，且具有较高的细菌浓度，其延迟期、对数生长期与稳定期分别为0~2，2~5和 5~8 d；BCM菌的延迟期、对数生长期与稳定期分别为0~3，3~7和7~9 d；而RHJ07菌的各生长对应时期分别为0~3，3~6和6~8 d，且发酵液中细菌浓度最低。各培养液的pH与黏度与细菌生长具有很强的关联性，在对数生长期pH快速降低，黏度快速升高，随后pH平缓下降，黏度平缓上升。BMN菌培养液中的pH与黏度在第7天分别下降至最低值(4.4)与上升至最高值(651 mPa·s)，而BCM与RHJ07菌培养液中的pH与黏度均在第9天分别达到最低值(5.1，5.4)和最高值(575，511 mPa·s)。随后随着发酵时间的延长，培养液中的pH开始缓慢上升，黏度开始缓慢降低，这是由于在发酵培养后期，环境的贫营养性致使细菌又重新利用自身代谢产生的有机酸、胞外多糖等所致。这表明，3株菌均有一定的产酸与产胞外多糖的能力，其中BMN菌的代谢能力最强。硅酸盐矿物与微生物相互作用机理研究表明^[6-8]，在硅酸盐矿物微生物风化分解过程中，“钾”细菌对含钾硅酸盐矿物中 K，Si和Al的溶出是由细菌产生的胞外多糖类物质与矿物中的金属元素结合成络合物的直接粘附作用以及细菌代谢产生的有机酸酸解硅酸盐或铝硅酸盐的非直接作用2部分组成的。

图1  三株“钾”细菌生长曲线与发酵液中pH、黏度随时间的变化规律

Fig. 1  Growth curves of three potassium strains and change of pH and viscosity values of supernatants with time

2.2  富钾火成岩细菌摇瓶浸出实验

吴涛等^{[5, 9-9]}的研究结果表明：不同来源的“钾”细菌对硅酸盐矿物的风化分解能力存在较大差别，即使同一菌种也因生长环境不同而导致其有不同的矿物风化能力。一般认为，具有较强产多糖能力的 BMN对含钾矿物的分解能力较强。而莫彬彬报道^[7]及作者前期研究表明：RHJ07与BCM之所以能风化分解硅酸盐矿物，除与它们产酸与产胞外多糖的能力有关外，还由于它们对矿物中的铁、锰等金属具有较强的还原作用，表明这类菌种在代谢过程中有产氧化还原酶的能力。正是由于不同菌种的生长代谢特性不同导致它们对矿物的风化分解机制也存在一定的差异，这种差异可能是各菌种在对矿物风化分解过程中具有一定协同作用的基础。为验证实验用的3株“钾”细菌的浸矿协同作用，采用摇瓶浸出实验对比分析了该3株菌种及它们的混合菌对富钾火成岩中主要金属元素K，Si和Al的溶出效果，结果见图2。

图2表明：BMN，RHJ07与BCM均对富钾火成岩中的K，Si和Al有一定的浸出效果，但存在明显的差别，BMN菌的浸出效果最好，浸出过程中上清液中 K₂O，SiO₂和Al₂O₃的最高质量浓度分别为0.83，5.80和2.1 g/L；其次为BCM，浸出液中K₂O，SiO₂和Al₂O₃的最高质量浓度分别为0.55，4.95和1.75 g/L；RHJ07的浸出效果最差，K₂O，SiO₂和Al₂O₃的最高质量浓度分别为0.41，3.01和1.25 g/L；而混合菌CMR的浸矿效果明显要好于各单一菌种，浸出液中K₂O，SiO₂和Al₂O₃的最高质量浓度分别达到1.38，6.26和2.85 g/L，表明各菌种在风化分解富钾火成岩的过程中具有协同作用。

从图2可以看出：在含不同细菌浸出体系中，尽管同一金属元素的溶出动力学规律基本相同，但不同金属元素(K，Si和Al)的溶出动力学存在明显不同的变化规律。

2.2.1  K的溶出规律

在含单一与混合菌的4种浸出体系中，浸出液中 K₂O质量浓度变化趋势基本一致，先后可以分为缓慢上升、快速上升、缓慢下降与轻度上升期 4 个阶段(图2(a))。但在不同的细菌浸出体系中，浸出液中 K₂O质量浓度变化的4个阶段略有差别，BMN浸出体系的4个阶段分别为1~4，4~7，7~13和13~15 d；BCM，RHJ07与CMR浸出体系的4个阶段分别为(1~3，3~ 8，8~12，12~15 d)，(1~5，5~ 10，10~13，13~15 d)，(1~4，4~9，9~12，12~15 d)。对照细菌生长曲线结果(图1(a))可知：K的溶出与细菌生长密切相关，在浸出的第1阶段，K₂O浓度缓慢上升，对应细菌生长的停滞期与对数生长前期，此阶段由于细菌活性低且基本不产生各种代谢产物，K的溶出是培养基溶液对矿物的微弱风化作用所致。在浸出的第2阶段(对应细菌的对数生长的中后期与稳定期及衰亡期前期)，由于细菌代谢产生了一定量的有机酸、氧化还原酶与胞外多糖，酸解、络解与氧化还原作用增强，K₂O质量浓度持续升高，同时细菌在对数生长期的活性最高，吸附在矿物表面的细菌在生长中会对矿物产生机械崩解作用，加速矿物颗粒的破碎，变得更细小，增大风化面积，使风化反应更易进行。在浸出的第三阶段，K₂O的质量浓度轻微下降，导致这一结果的可能原因是 K是细菌生长的必需元素，在此阶段细菌 K 的溶出量低于细菌消耗量。在浸出的最后阶段，K₂O的质量浓度又轻微上升的可能原因是该阶段细胞发生分解，又释放生长时消耗的K所致。

2.2.2  Si的溶出规律

在4种单一与混合菌浸出体系中，在15 d的浸出周期内，各浸出液中SiO₂质量浓度均持续升高，但溶出速率与细菌生长代谢活性密切相关(图2(b))。在浸出前期(对应细菌生长的停滞期)，SiO₂质量浓度上升缓慢，其原因可能是细菌代谢活性较低，较少产酸与胞外聚合物，因此富钾火成岩通过质子交换与配体络合2种方式产生溶解的能力均较弱。而在浸出后期(细菌生长衰亡期中后期)SiO₂质量浓度增幅速率很小的可能原因是该阶段浸出液处于贫营养状态，细菌开始自溶，细菌的氧化还原能力及酸解与络解作用显著降低所致。在细菌生长的对数期与稳定期，浸出液中SiO₂质量浓度增幅速率显著，也可能是该阶段细菌对矿物的机械破坏、质子交换、配体络合及氧化还原作用增强所致。作者前期研究表明：矿物中不同金属元素的溶出机制略有不同，K与Si的溶出主要受细菌间接作用机制的影响，而Al的溶出主要受细菌直接作用机制的影响。因此，具有较强产小分子有机酸与胞外多糖能力的“钾”细菌对硅酸盐矿物中K与Si的溶出能力较强。

2.2.3  Al的溶出规律

在4种细菌浸出体系中，除浸出速率不同外，Al的溶出整体上均可以分为上升与下降2个阶段(图2(c))。在细菌的对数生长期与稳定期，浸出液中Al₂O₃的质量浓度显著增加，与SiO₂的溶出规律相同，但研究认为Al的溶出主要受细菌—矿物直接作用机制的影响，特别是在细菌生长的对数期后期与稳定期，由于矿物表面生物膜及细菌—矿物复合体的形成，提高了细菌及代谢产物对矿物中Al的溶出能力，Al的溶出量明显大于代谢产物吸附絮凝沉淀的量。进入细菌生长的衰亡期后，Al₂O₃的质量浓度显著降低，该阶段的一个显著特征是代谢产物与细菌出现了絮凝，形成了大量絮状物，溶出的Al因受代谢产物的絮凝沉淀而降低(由于细菌生长对Al和Si需求极少，因此，这一变化过程可能与细菌生长的吸收利用无关)。Zhou等^[17]研究结果表明：细菌—矿物直接接触作用表现出细菌对Al的溶出作用增强，而隔离实验则反映了代谢产物对Al的抑制作用；高岭石、伊利石、叶蜡石与石英或Si离子的微细颗粒在细菌所产生的多糖溶液中具有良好的分散性能，而同样直径的一水铝石或Al离子在该溶液中很快会絮凝沉淀。

图2  摇瓶浸出实验结果

Fig. 2  Results of flask bioleaching

2.3  富钾火成岩细菌连续浸出实验

目前有硅酸盐矿物的微生物风化分解实验均在摇瓶浸出体系中进行，尚无有关利用连续浸出工艺浸出含钾硅酸盐矿物的相关报道。有关金属矿的微生物浸出实验结果表明：连续浸出可以显著提高细菌活性和浸出速率。为此，为进一步研究浸矿效果较好的单一菌BMN和混合菌CMR对矿物的风化分解能力，实验采用连续浸出体系浸出富钾火成岩。实验过程中当连续浸出装置的液流稳定后，并在保证连续浸出装置中的3个容器的浸出环境基本一致的情况下，每隔1 d从3个容器中取1 mL浸出液并混合，分别测定其中的K₂O、SiO₂、Al₂O₃质量浓度，结果见图3。同时，分析了浸出液中细菌数量及可溶性与不溶性金属氧化物(K₂O、SiO₂、Al₂O₃)的质量分数，结果见图4。

从图3可见：单一菌BMN与混合菌CMR在连续浸出体系中对富钾火成岩中的K，Si和Al的溶出速率及溶出量明显要比在摇瓶浸出体系中的快与高，且K和Al的溶出规律略有差异；在为期15 d的浸出周期内，BMN与CMR的浸出上清液中K₂O的最高质量浓度分别为1.21和1.78 g/L，SiO₂的最高质量浓度分别为7.41和9.79 g/L，Al₂O₃的最高质量浓度分别为3.12和4.58 g/L；到第15 d浸出结束时，在BMN的连续浸出体系中，K₂O，SiO₂和Al₂O₃的浸出率分别为30.50%，25.44%和28.39%，而在摇瓶浸出体系中的最终浸出率分别为18.44%，19.92%和7.25%；在CMR连续浸出体系中，分别可以浸出52.36%的K₂O，33.62%的SiO₂与40.55%的Al₂O₃，而对应的摇瓶浸出率分别只有30.64%，21.49%和9.91%，这一结果说明连续浸出体系可以显著促进富钾火成岩的细菌风化分解能力，提高单一与混合菌的浸出效率。在 K，Si和Al的溶出动力学规律上，浸出液中SiO₂质量浓度随浸出时间的变化规律与摇瓶浸出体系中的相似，而K和Al的溶出表现出略为不同的动力学特征。在连续浸出的15 d内，浸出液中K₂O质量浓度随浸出时间的延长持续升高，没有表现出在摇瓶浸出体系中K₂O质量浓度轻度下降的阶段，这表明在整个浸出周期内细菌对K的溶出量大于细菌对K的消耗量；对Al的溶出，在浸出的前12 d，溶出规律与摇瓶浸出相似，可分为上升与下降2个阶段，但上升速率明显要快，下降幅度明显变缓；而到浸出的第12天后，浸出液中Al₂O₃质量浓度又开始轻度上升，表现出与摇瓶浸出相反的动力学特征。

已有生物浸矿及矿物微生物风化实验结果表明^[6-9]：矿物的风化分解速率与微生物的生长代谢活性密切相关，处于对数生长期的微生物对矿物的溶蚀能力明显要高于处于延迟期或稳定期与衰亡期的微生物对矿物的溶蚀能力。对细菌的生物生长与代谢活泼性研究表明：在浸出或发酵培养过程开始时，细菌的活泼性最弱；在浸出过程的中期，由于形成了培养物发展的最佳条件，此时细菌的活泼性最高；而在浸出的后期，由于聚集了一些有毒物质与浸出液中营养物质的大量减少而使细菌活性降低。在摇瓶浸出体系中，细菌生长均存在明显的延迟期与较短的对数生长期，并随着发酵时间的延长，细菌的活性逐渐降低并有大量自溶死亡。很显然，延迟期是导致细菌浸矿周期延长的原因之一，而浸出液中活性细菌数量降低是导致K，Si和Al浸出率较低的主要因素。而在连续浸出体系中是循环利用过滤后的细菌溶液，细菌与矿物颗粒之间接触比摇瓶浸出体系更加充分，过滤可以消除部分浸出液中聚集的对细菌有抑制作用的有毒物质，同时用新鲜培养基补充浸矿或过滤中损失的浸出液，因此，细菌的活性会在浸出过程中迅速恢复。从图4(a)可以看出：在15 d的浸出时间内，单一菌BMN与混合菌CMR没有明显的延迟期，基本处于对数生长期，表明菌种在浸矿周期内具有较高的活性，且浸出结束时浸出液中的pH保持在5.3左右，产酸能力略高于摇瓶浸出体系时的产酸能力，这可能是细菌在连续浸出体系中浸出能力要高于摇瓶浸出体系中的主要原因。

图3  连续浸出实验结果

Fig. 3  Results of continuous bioleaching

浸出结束后，分析浸出液中可溶性与不溶性金属氧化物的质量分数(图4(b))。结果表明：浸出液中可溶性 K₂O的质量分数(62.42%)明显要高于不溶性 K₂O的质量分数(27.58%)，而可溶性与不溶性的 SiO₂和Al₂O₃的质量分数基本相近。这一结果进一步表明：K的溶出主要受细菌及代谢产物的生物化学作用(间接溶出机制)的影响，而Si和Al的溶出除受生物化学作用的影响外，代谢产物的生物物理浮选作用也是十分重要的因素之一。当矿物颗粒越细，浸出液中不溶性的K，Si和Al含量越高，导致这一结果的原因是：1) 在较细粒度下，一部分硅酸盐矿物单体(高岭石、伊利石、石英、钾长石)从组成复杂的矿物中解离出来，而这些矿物的微细颗粒(粒度≤45 μm)在细菌多糖溶液中具有良好的分散性能；2) 这些矿物在细菌的溶蚀作用下分解成了水铝石与石英，石英在此多糖溶液中具有比上述矿物更好的分散性能，而水铝石则絮凝沉淀形成精矿。

图4  连续浸出体系中细菌生长曲线及可溶性与不溶性金属氧化物的质量分数

Fig. 4  Growth curves of CMR and BMN and percentages of soluble and insoluble metallic oxides

2.4  浸渣的SEM与XRD及浸出液的IR分析

富钾火成岩原矿及被CMR摇瓶浸出与连续浸出15 d后的浸渣样品的SEM与XRD分析结果见图5与图6；不同浸出方式的浸出液的红外光谱分析结果见图7。

从图5(a)可以看出：未经细菌作用的富钾火成岩原矿矿物颗粒表面光滑，棱角分明，凹凸不平状明显，晶体结构完整；而经细菌作用后的富钾火成岩颗粒表面发生了明显的变化，矿样被摇瓶浸出15 d后，矿物颗粒大的棱角与凸起部分被分裂成更多细小棱角，边缘变得模糊不清，矿样表面出现了大量的溶蚀坑(图5(b))；而图5(c)表明：连续浸出方式比摇瓶浸出方式对富钾火成岩的溶蚀作用更为明显，凸起的棱角完全被溶蚀，细小颗粒及非晶态物质显著增多，矿物晶体结构基本被破坏，且在细菌分泌的胞外大分子物质的交联作用下，颗粒相互粘连在一起而成絮状。

图6(a)表明：未经细菌作用的富钾火成岩原矿中主要矿物为钾长石，傍生矿物主要有霞石、绿泥石、白榴石、绢云母与辉石等不同结构的硅酸盐矿物，其XRD图谱中反映它们的晶体结构的特征峰明显；而经混合菌CMR浸出作用15 d后，在摇瓶浸出体系中的浸渣样品XRD图谱中(图6(b))，白榴石、绿泥石、辉石与霞石的特征锐锋均有明显下降；而在连续浸出体系中的浸渣样品XRD图谱中(图6(c))，其反映白榴石、绿泥石、绢云母与辉石的特征峰基本消失，反映霞石与钾长石的各特征峰下降更为显著并有部分消失，且出现了反映水铝石的新特征锐锋。这表明：被细菌分解的硅酸盐矿物转化成了水铝石；混合菌CMR在连续浸出体系中对富钾火成岩的溶蚀效果要比在摇瓶浸出体系中的好。这与作者前期研究^[6-9]及莫彬彬等^[7]的结果一致。他们认为，试验条件下，硅酸盐细菌对不同晶体结构的硅酸盐矿物存在明确的风化序列，具层状结构的云母、绿泥石较架状结构的霞石与钾长石容易被首先风化，并在风化过程中有可能转化成水铝石、石英等其他晶体结构的铝硅酸盐矿物，硅酸盐细菌对不同结构矿物的分解作用有一定的选择性。富钾火成岩是由多种矿物组成的，在多种矿物共存的条件下，细菌对富钾火成岩的分解作用会因矿物晶体结构的不同而在作用强弱或快慢上表现出明显差异，从而对不同类型的矿物行使不同程度的破坏作用，微生物对矿物的破坏作用不仅表现在不同矿物之间，也表现在同种矿物的不同部位之间。

图5 富钾火成岩原矿及被混合菌摇瓶浸出与连续浸出15 d后的浸渣样品的SEM图

Fig. 5  SEMs of rich potassium igneous rock raw ore and leaching dregs of flask leaching and continuous leaching by mixed culture

作者前期研究结果^[8-9]表明：不同来源的硅酸盐细菌在发酵培养与浸矿过程中可以代谢产生草酸、苹果酸、酒石酸与柠檬酸及大分子胞外多糖物质，且铝硅酸盐矿物可以显著促进细菌产代谢产物的能力；而代谢产物可以通过酸解、络解的方式风化分解铝硅酸盐矿物，将不溶性的Si，Al，K和Fe等元素转变成可溶性的离子或有机络合物。从混合菌各发酵液与浸出液的红外光谱图(图7)可以看出：3组不同浸出液均具有碳水化合物的典型吸收峰。在官能团区3 400 cm^-1附近归属为O—H 伸缩振动，峰强且宽，说明3组浸出液中均有大量的OH^-，但强度有明显差别，由强到弱分别为富钾火成岩连续浸出液(A)，富钾火成岩摇瓶浸出液(B)，无矿物的发酵液(C)，说明富钾火成岩矿粉可以诱导细菌产生更多的胞外多糖与有机酸等代谢产物，且浸出方式对细菌代谢能力也有明显的影响；从峰形区别，浸出液A与B的峰形比浸出液C的宽，推测浸出液A和B中还可能存在螯合的羟基，这很可能是由细菌代谢产生多糖等的羟基与矿粉中阳离子螯合而成。在3组浸出液的IR图中，均有C=O(1 627 cm^-1附近)、—CH₃(1 371 cm^-1附近)、C—O(1 030 cm^-1附近)伸缩振动，但强度也存在明显差别，表现出与O—H伸缩振动相同的规律，进一步说明矿物可以刺激与促进细菌的代谢能力；在指纹区，浸出液A与浸出液B 在2 923 cm^-1和2 270 cm^-1附近出现了2个明显的新吸收峰，特别是浸出液A在900~500 cm^-1区间的吸收峰明显增多，含有白榴石、绿泥石与钾长石等的Si—O与Al—O特征峰，说明加了富钾火成岩矿粉的2个实验组除了有多糖等代谢产物的特征官能团的伸缩振动外，还含有Si—O和Al—O等铝硅酸盐矿物的特征峰，这很可能是由于有机酸和多糖等代谢产物的螯合作用使得火成岩中的Si和Al易于与其复合在一起，明显区别于不含火成岩的细菌发酵液的红外光谱结构。

图6  富钾火成岩原矿及被混合菌摇瓶与连续浸出后的XRD图

Fig. 6  XRD patterns of raw ore and dregs of batch leaching and continuous leaching by CMR

图7  浸出液红外光谱图

Fig. 7  IR patterns of supernatants

2.5  浸矿过程中“钾”细菌群落的动态演替

在摇瓶浸出与连续浸出2种浸出体系中，选取富钾火成岩浸出效果较好的连续浸出体系作为研究对象，分析浸矿过程中混合菌种群落结构变化规律。分别在浸出的第3，6，9，12和15天从浸出液中取样，进行稀释涂布平板培养，通过对菌株的分离纯化，随机挑选200个菌落进行生理生化与表型特征鉴别，各样品中3种“钾”细菌的比例结果见图8。从图8可以看出：在第3天和第6天的样品中，各菌种质量分数差异不大，Bacillus mucilaginosus BMN所占比例最高，分别为40% 和46.7%，而Bacillus circulans BCM和Rhizobium spp.RHJ07分别各占32.7%，30%和27.3%，21.7%；在第9天样品中，BCM与BMN菌明显为优势菌种，质量分数分别为41.4%与45%。而当浸出到第12天及后阶段，浸矿微生物的群落组成发生了更加明显的变化。随着浸出时间的延长，RHJ07菌种所占比例大幅降低，在第15天的样品中只占5.7%；BCM所占比例也有较大幅度降低，在第12和15天分别为18.8%和18%；而BMN所占比例迅速增加，在第12和15天样品中各占73.3%和76.3%。

通过各样品分析结果的对比可以看出，在富钾火成岩的浸出前期(0~6 d)，浸矿体系中3种硅酸盐细菌所占比例差异较小，没有明显的优势菌种；浸矿中期，BCM与BMN同为优势菌种；而到了浸矿的后期，BMN的比例明显上升，并最后取代BCM和RHJ07成为优势菌种。因此，可以推测，在浸出过程中浸出环境的生物及物理化学性质的改变对“钾”细菌的群落组成产生了影响，这些因素可能是浸出体系中各离子浓度、pH、作为微生物生长能源的有机营养物质(如蔗糖)浓度等。

图8  各菌种在5个样品中所占质量分数

Fig. 8  Mass fractions of each tested bacterial strains

3  结论

1) 摇瓶浸出实验结果表明：混合“钾”细菌 CMR 具有较高的浸出效率，到第15天浸出结束，K₂O，SiO₂和Al₂O₃的浸出率分别为30.67%，21.49%和9.91%；而3株单一“钾”细菌中，BMN的浸矿效果最好，但K₂O，SiO₂和Al₂O₃的浸出率也明显比混合菌CMR的低，分别为18.44%，19.92%和7.25%。

2) 与摇瓶浸出实验结果相比，连续浸出方式可以显著提高单一与混合“钾”细菌的浸矿效率。连续浸出15 d后，BMN可以分别浸出富钾火成岩中30.50%，25.44%和28.39%的K₂O，SiO₂和Al₂O₃，而CMR的浸出效果明显较BMN的浸出效果要好，K₂O，SiO₂和Al₂O₃的浸出率分别到达52.36%，33.62%和40.55%。进一步说明3株实验用“钾”细菌在对富钾火成岩的浸出过程中具有协同作用。

3) “钾”细菌对富钾火成岩的分解作用是通过其代谢产物的酸解、络解等化学作用及胞外大分子物质(如多糖)对矿物的生物浮选作用等各种因素协同作用的结果。

4) 在富钾火成岩混合菌浸出前期，3株菌种的比例相差不大，没有明显的优势菌种；浸矿中期，BCM与BMN同为优势菌种；而到浸矿后期，Bacillus mucilaginosus BMN在群落中的比例会上升，并最后取代Bacillus circulans BCM和Rhizobium spp. RHJ07成为优势菌种。

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(编辑  何运斌)

收稿日期：2013-08-03；修回日期：2013-10-09

基金项目：国家自然科学基金资助项目(51264014，31360064)；江西省教育厅科技项目(2008GZN0045)

通信作者：孙德四(1967-)，男，湖南益阳人，博士，教授，从事微生物浸矿技术研究；电话：15170295286；E-mail: sundesi1215@126.com