简介概要

稀有金属离子与巯嘌呤血清白蛋白相互作用的研究

来源期刊：稀有金属2001年第6期

论文作者：黄志娜张瑶舒张贵珠卢继新

关键词：金属离子; 巯嘌呤; 血清白蛋白;

摘要：用紫外光谱、荧光光谱研究了多种稀有金属离子与抗癌药物巯嘌呤(mercaptopurine,MP)、血清白蛋白的相互作用;并通过对它们之间的结合常数、结合位置数、作用力类型的研究,为稀有金属离子参与癌症治疗、抗癌药物的合成提供了有益的参考.

稀有金属 2001,(06),423-426+451 DOI:10.13373/j.cnki.cjrm.2001.06.006

稀有金属离子与巯嘌呤血清白蛋白相互作用的研究

卢继新黄志娜张瑶舒

南开大学化学系,天津医科大学药学院,南开大学化学系,天津医科大学药学院天津300071 ,天津300203 ,天津300071 ,天津300203

摘要：

用紫外光谱、荧光光谱研究了多种稀有金属离子与抗癌药物巯嘌呤 (mercaptopurine , MP) 、血清白蛋白的相互作用 ;并通过对它们之间的结合常数、结合位置数、作用力类型的研究 , 为稀有金属离子参与癌症治疗、抗癌药物的合成提供了有益的参考。

关键词：

金属离子;巯嘌呤;血清白蛋白;

中图分类号： TQ460.72

作者简介：卢继新, 联系人;联系地址:天津医科大学药学院;

收稿日期：2001-03-05

基金：国家自然科学基金资助项目 (N0 .2 95 75 2 0 0 );天津医科大学自然科学基金资助课题;

Study on Interaction of Rare Metal Ions with Mercaptopurine and Serum Albumin

Abstract：

The interaction between various rare metals and anti cancer mercaptopurine (MP) , serum albumin were studied by using spectral metho ds of UV-absorption and fluorescence. The useful consultation was offere d by determining the binding costant, the number of binding sites, the type of binding force for the syntheses and the treatment of anticancer with rare metal ion to participate.

Keyword：

Metalions; Mercapto purine; Serum albumin;

Received： 2001-03-05

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白, 它具有广泛的结合能力, 能结合内源性、外源性物质 ^[1] , 能结合大、中、小分子化合物, 也能同难溶于水的物质结合, 具有重要的生理意义。生物体内还存在多种微量元素, 它们往往是通过生物大分子改变构象, 在生物大分子中成为结构中心, 或产生活性中心等参与重要的生命过程 ^[2,3,4] 。因此, 研究药物与血清白蛋白、金属离子的相互作用, 对于了解药物在体内的状态、储运、吸收、代谢及药理作用具有重要意义 ^[5,6] 。

图1 巯嘌呤的结构式Fig.1 Structural formula of MP

巯嘌呤是抗代谢类抗肿瘤药物, 临床广泛用于治疗淋巴瘤、白血病等各种增殖很快的肿瘤。其作用机理认为它能阻断次黄嘌呤转变为腺嘌呤核酐酸和鸟嘌呤核酐酸, 故而抑制核酸的合成 ^[7] 。本文用多种方法在生理条件下详细研究了多种稀有金属离子与巯嘌呤、牛血清白蛋白、人血清白蛋白的作用, 测定了它们之间的结合常数、结合位置数, 并研究了它们之间的作用力类型, 为金属离子参与癌症的治疗, 抗癌药物的合成、临床用药提供了有益参考。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

岛津 RF-510 型荧光光度计, 岛津 UV-240型紫外可见分光光度计, 德国MY-870型pH计。牛血清白蛋白 (BSA) 、人血清白蛋白 (HSA) 购自华美生物工程公司, 巯嘌呤购自北京药品检验所, 缓冲液由 0.1 mol·L^-1 Tris 溶液与 0.1mol·L^-1 盐酸配至 pH=7.2。其它试剂均为国产分析纯, 实验用水均为去离子重蒸水。

1.2 实验方法

两只 10 ml 具塞试管中分别依次加入一定体积的 Tris-HCl 缓冲液, 0.5 mol·L^-1 NaCl 溶液, BSA (HSA溶液) , 用水稀释至 10 ml 摇匀, 固定激发波长为 284 nm, 发射波长为 280～520 nm, 扫描BSA和HSA的荧光光谱。

在 10 ml 比色管中加入一定量的金属离子溶液, Tris-HCl 缓冲溶液, 巯嘌呤溶液, 用生理盐水稀释至 10 ml, 以试剂为空白, 用1 cm吸收池于400～200 nm 波长范围测定巯嘌呤金属离子相互作用的吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 金属离子与巯嘌呤的相互作用

剖析抗癌药物巯嘌呤的结构, 发现它含有与金属离子作用的结合基;为此, 我们研究了5种金属离子Cu²⁺、Au³⁺、 Pt³⁺、Pd²⁺、Cd²⁺与巯嘌呤的作用。实验表明, 在pH=7.2 条件下, 这些金属可与巯嘌呤形成稳定配合物, 其光谱如图2所示, 光谱性质见表1。

图2 金属离子与巯嘌呤配合物的吸收光谱

Fig.2 Absorption spectra of metal ion with MP complex

1—巯嘌呤;2-Cd-巯嘌呤;3-Pt-巯嘌呤;4-Au-巯嘌呤;5-Cu-巯嘌呤;6-Pd-巯嘌呤;c_Me=2.5×10^-5 mol·L^-1, c_巯嘌呤=2.0×10^-5mol·L^-1, pH=7.2

表1 金属离子与巯嘌呤配合物吸收光谱的特征及有关参数

Table 1 Characteristic of absorption spectra of metal ions with MP complex and concerned parameter

配合物	λ_max/nm	Δλ/nm	ε/×10⁴	形成常数	结合比
Cu²⁺-巯嘌呤	280	44	0.48	3.14×10⁹	1∶2
Au³⁺-巯嘌呤	246	78	0.70	1.16×10⁹	1∶1
Pt³⁺-巯嘌呤	297	27	0.73	8.92×10⁹	1∶1
Pd²⁺-巯嘌呤	256	68	0.62	1.59×10⁹	1∶1
Cd²⁺-巯嘌呤	318	6	1.40	1.02×10¹¹	1∶2

2.2 金属离子与巯嘌呤反应的化学计量

采用摩尔比法和连续变化法作为对照, 测定了巯嘌呤与几种金属离子反应的化学计量, 发现金属离子不同可分别形成2∶1和1∶1的配合物, 其具体数据见表1。

2.3 酸度对金属离子参与反应的影响

通过对酸性、中性、碱性等介质中金属离子与巯嘌呤相互作用的研究, 发现Au³⁺、 Pt³⁺、Pd²⁺在酸性或中性介质中能与巯嘌呤发生反应, 并形成稳定络合物;而Cu²⁺、Cd²⁺在中性或弱碱性介质中可与巯嘌呤反应, 并形成稳定的络合物。这可能是由于Au³⁺、 Pt³⁺、Pd²⁺等离子在碱性介质中容易发生水解而很难与药物进行反应。为了与体液接近, 故选 pH=7.0。

2.4 巯嘌呤与血清白蛋白的相互作用

蛋白质中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧光。随着巯嘌呤浓度的增加, HSA、BSA的荧光强度有规律的降低, 发射峰峰位及峰形不变。图3说明了巯嘌呤对HSA、BSA的荧光粹灭现象。

为了进一步证明其粹灭过程, 用动态粹灭的 Stern-Volmer方程 ^[8] 进行验证。

F₀/F=1+K_qτ₀[Q] = 1 + K_sv[Q] (1)

其中, F₀是粹灭剂不存在时的荧光强度, F是加入粹灭剂以后的荧光强度, K_q是双分子粹灭过程速率常数, K_sv是动态粹灭常数, τ₀是粹灭剂不存在时荧光分子平均寿命, [Q]是粹灭剂浓度。图4为巯嘌呤对BSA、HSA 粹灭的 Stem-Volmer 图。由图4可以得到K_sv, K_{sv, HSA}=1.69×10⁴ (moL/L) ^-1, K_{sv, BSA}=4.00×10⁴ (moL/L) ^-1。由于生物大分子荧光寿命大约为10^-8s ^[9] , 由方程

K_qτ₀=K_sv (2)

可以得到K_q (K_{q, HSA}=1.69×10¹² (moL/L) ^-1·s^-1, K_{q, BSA}=4×10¹² (moL/L) ^-1·s^-1) , 远远大于各类粹灭剂对生物大分子的最大扩散常数 2.0×10¹⁰ (moL/L) ^-1·s^-1 ^[10] , 所以粹灭不是由于动态碰撞引起的, 而是由于巯嘌呤与血清白蛋白形成配合物而引起的静态粹灭 ^[11] 。

2.5 巯嘌呤与血清白蛋白的结合常数

由于巯嘌呤与血清白蛋白形成配合物而引起静态粹灭, 因此可以用静态粹灭公式 ^[8] 得到巯嘌呤与血清白蛋白的结合常数:

(F₀-F) ^-1=F₀^-1+K_DF₀^-1[Q]^-1 (3)

由斜率可以求出血清白蛋白与巯嘌呤的结合常数K (K=K_D^-1) ∶K_HSA=9.70×10³ (moL/L) ^-1, K_BSA=1.62×10⁴ (moL/L) ^-1, 这说明巯嘌呤与血清白蛋白有较强的结合能力, 可以在体内被血清白蛋白储存转运。

图3 巯嘌呤对HSA (a) 、BSA (b) 的荧光光谱的影响

Fig.3 Fluorescence spectrum of HSA, BSA with increasing concentration of MP

(a) λ_ex=284nm; (b) λ_em=345nm;c_BSA=c_HSA=2.0×10^-6 mol·L^-11—c_巯嘌呤=0;2—c_巯嘌呤=2 mol·L^-1;3—c_巯嘌呤=4 mol·L^-1;4—c_巯嘌呤=6 mol·L^-1;5—c_巯嘌呤=8 mol·L^-1;6—c_巯嘌呤=10 mol·L^-1

图4 巯嘌呤对BSA、 HSA粹灭的Stern-Volmer图

Fig.4 Stern-volmer quenching plot of BSA, HSA with increasing concentration of MP

(a) λ_ex=284nm; (b) λ_em=345 nm1—25℃;2—35℃

2.6 金属离子对药物与血清白蛋白结合常数的影响

如前所述, 巯嘌呤与血清白蛋白有一定的结合能力, 金属离子与巯嘌呤药物有强的结合力 , 金属离子与血清白蛋白也有一定的结合能力 ^[12] , 金属离子的存在会直接影响药物与蛋白质的结合;为此测定了多种金属离子存在下药物与HSA的形成常数K′, 结果列于表2, 发现金属离子的存在对药物与血清白蛋白的结合常数有影响, 它使得药物与人血清白蛋白的结合增强, 从而使巯嘌呤更好地被白蛋白所储存、运载, 这样药物在血浆中储留的时间将延长, 可以达到缓释的目的, 减小药物的毒性。

2.7 药物与白蛋白结合位置数的求取及金属离子对结合位置数的影响

研究药物与白蛋白的结合位置数以及金属离子的存在对其结合位置数的影响, 直接关系到抗癌药物的药效及用药过程, 所以通过静态粹灭过程的研究, 依据粹灭关系式 ^[13] ,

lg (F₀-F) /F= lgK + nlg[Q] (4)

以lg (F₀-F) /F对lg[Q]作图, 由斜率可以求出结合位置数n。由表2可以看出, 巯嘌呤与人血清白蛋白的结合位置数为1.1, 金属离子的存在不影响结合位置数。

2.8 巯嘌呤在HSA、BSA上结合位置的确定

作巯嘌呤的紫外-可见吸收光谱图 (见图5) , 由图5发现其与 HSA、BSA 的荧光光谱有较大的重叠。根据 Foster ^[14] 提出的偶极-偶极非辐射能量转移理论, 可以得到巯嘌呤与分子中发荧光基团之间的距离, 对 280～440 nm 波长范围进行积分, 求得重叠积分J, 进而求得巯嘌呤距HSA、BSA上色氨酸残基的距离r, r_HSA=4.08nm, r_BSA=3.35nm, 均小于7nm, 说明它们之间发生了能量转移。

表2 金属离子存在下药物与人血清白蛋白的结合常数与结合位置数Tabe.2 Binding constant and binding site number of HSA and MP with metalions existing

离子种类	K′ (mol/L^-1)	K′/K	n
-	9.7×10³	1.0	1.1
Cu²⁺	2.7×10⁴	2.78	0.8
Au³⁺	2.9×10⁴	2.99	0.9
Cd²⁺	1.6×10⁴	1.65	0.9
Pd²⁺	5.5×10⁴	5.67	0.9
Pt³⁺	1.4×10⁴	1.53	1.0

图5 巯嘌呤的吸收光谱与 HSA、BSA 的荧光发射光谱

Fig.5 Absorption spectrum of MP and fluorescence spectrum of HSA, BSA

2.9 药物与血清白蛋白之间作用力的确定

药物与生物大分子之间的相互作用力包括氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力等。药物不同, 其作用力类型也不同。当温度变化不大时, 反应的焓变可以看作一个常数, 由式 (5) 、 (6) 、 (7) 可以求出ΔH、ΔG、ΔS (ΔG为自由能, ΔS为熵变) 。

lg (k₂/k₁) = (1/T₁-1/T₂) ΔH/R (5)

ΔG =ΔH - TΔS (6)

ΔG = -RTlnK (7)

通过测定25℃和35℃的结合常数:K_25℃=9.70×10³ (moL/L) ^-1, K_35℃=1.48×10⁴ (moL/L) ^-1, 可以看出温度对巯嘌呤和人血清白蛋白的结合常数几乎没有什么影响, 由此可得ΔH和ΔS, ΔH=14.00 kJ/mol, ΔS=1.27×10² J/mol, ΔH>0, ΔS>0, 所以认为巯嘌呤与人血清白蛋白之间的相互作用力为疏水作用力 ^[15] 。