DOI: 10.11817/j.issn.1672-7207.2018.07.006
基于色谱二维数据的鼎药方术归姜与其药对相关成分的化学计量学分析
张斌1, 2，李晓如1
(1. 中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；
2. 长沙环境保护职业技术学院 环境监测系，湖南 长沙，410004)
摘要：运用GC-MS联用仪测定鼎药方术归姜及其药对挥发油化学成分，采用交互移动窗口因子法对其共有组分进行比较分析, 结合直观推导式演进特征投影法对重叠峰进行分辨，应用质谱库相似度匹配和计算保留指数对各组分进行定性，采用总体积积分法定量。研究结果表明：对鼎药方术归姜、药对归姜、药对术姜和药对术归分别鉴定出35，73，41和58个组分，其体积分别占挥发油总体积的90.16%，95.56%，92.78%和96.16%；鼎药方中有5种组分来自于药对归姜，有3种组分来自于药对术归，与3个药对共有组分5种。
关键词：鼎药方；白术；当归；干姜；气相色谱-质谱(GC-MS)；交互移动窗口因子分析法(AMWFA)；直观推导式演进特征投影法(HELP)
中图分类号：O629.9 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2018)07-1612-08
Analysis of related volatile constituents in triherbal recipe atractylodes macrocephala-angelica sinensis-zingiber officinale rosc by hyphenated chromatographic data and chemometric resolution method
ZHANG Bin1, 2, LI Xiaoru1
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;
2. School of Environmental Monitoring, Changsha Environmental Protection College, Changsha 410004, China)
Abstract: Analysis of volatile components in triherbal recipe atractylodes macrocephala-angelica sinensis-zingiber officinale(AAZ), herbal pair atracylodes macrocephala-angelica sinensis(AA), herbal pair angelica sinensis-zingiber officinale(AZO) and herbal pair atractylodes macrocephala-zingiber officinale(AZ) were performed with two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS) data coupled with alternative moving window factor analysis(AMWFA) and heuristic evolving latent projections(HELP). The results show that, by means of these methods, 35, 73, 41 and 58 volatile chemical components in essential oil of AAZ, AZO, AZ and AA were determined qualitatively and quantitatively, accounting for 90.16%, 95.56%, 92.78% and 96.16% total contents of essential oil of AAZ, AZO, AZ and AA, respectively. There are 5 active constituents coming from herbal pair AZO in triherbal recipe, and 3 active constituents coming from herbal pair AA in triherbal recipe, and there are 5 common active constituents among them.
Key words: triherbal recipe; Atractylodes macrocephala; Angelica sinensis; Zingiber officinale; gas chromatography- mass spectrometry; alternative moving window factor analysis; heuristic evolving latent projections
现代中药研究的重要课题之一就是阐明复方临床药效的物质基础即化学成分，而复方的配伍关系非常复杂，给研究工作带来极大困难。3个单味药所构成的方剂即为中药鼎药方，且任取其中2个单味药均可构成药对。对药对和鼎药方进行研究，可为中药复方配伍的研究提供依据和模式[1]。中药鼎药方的提出为复方的组方和拆方提供了便利。通过研究鼎药方配伍前后挥发油成分的变化，有利于研究复方的挥发油化学成分，对于研究复方的配伍机制和创制新的复方，促进中医药理论的现代化具有重要的现实意义[1]。白术(Atractylodes macrocephala)常用于健脾益气、消痞除胀、燥湿止泻，当归(Angelica sinensis)具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠的疗效 ，干姜(Zingiber officinale)用于治疗脘腹冷痛、呕吐泄泻、肢冷脉微等病症。这3种物质既能组成鼎药方，也能两两配对组成药对。白术与当归配伍，组成药对术归(AA)，能健脾气、益心血；白术与干姜配伍，形成药对术姜(AZ)，具有健脾燥湿、化痰截虐的作用；当归与干姜配伍，组成药对归姜(AZO)，具有养血破湿之功效；鼎药方术归姜(AAZ)由白术、当归和干姜这3味单味药组成，主治眩晕心悸、脾虚食少、血虚萎黄[2]。本文作者分别提取鼎药方术归姜及其药对的挥发油成分，运用GC-MS联用仪进行检测，采用交互移动窗口因子法(alternative moving window factor analysis，AMWFA)对其共有组分进行比较分析，结合直观推导式演进特征投影法 (heuristic evolving latent projections，HELP)对重叠峰进行分辨，应用质谱库相似度匹配和计算保留指数对各组分进行定性，采用总体积积分法定量[3-10]，比较鼎药方术归姜与其药对挥发油化学成分，分析鼎药方术归姜配伍前后挥发油成分的变化。
1 实验
1.1 仪器和药材
仪器为日本岛津QP20l0型气相色谱仪-质谱仪。药材为：干姜、当归、白术，均购于芝林大药房，经湖南中医药研究所鉴定；正构烷烃C8-C20和C21-C40(瑞士Fluka Chemika公司)；正己烷(分析纯)。
1.2 挥发油提取
称取药对归姜(当归和干姜各25 g)、药对术归(白术和当归各25 g)、药对术姜(白术和干姜各25 g)、鼎药方术归姜(白术、当归、干姜各25 g )，分别与水以质量比1:8混合，按照《中国药典》[11]中挥发油提取方法提取。
1.3 挥发油和正构烷烃参照系的测定条件
色谱条件：色谱柱为 OV-I(长度×内径为30 m× 0.25 mm)，载气为He。起始温度为60 ℃，维持2 min，按升温速度5 ℃/min升至130 ℃，维持3 min，再以4 ℃/min升至260 ℃，维持4 min。流速为0.7 mL/min，进样量为1 μL；进口温度为250 ℃，界面温度为250 ℃，分流比为1:20。
质谱条件：EI源电子能量为70 eV，离子源温度为200 ℃；倍增电压为0.9 kV， 质荷比m/z扫描范围为35~800，扫描速率为3.8 次/s，溶剂延迟3 min。
1.4 数据分析
数据分析在Gateway T8100计算机上进行，程序用MATLAB 6.5编写, 采用NIST107质谱库进行检索。
2 结果与讨论
2.1 交互移动窗口因子分析法(AMWFA)
图1所示为药对归姜、药对术姜、药对术归和鼎药方术归姜挥发油的GC-MS总离子流图谱(TIC)。由图1可知：上述药方的成分非常复杂，且有很多重叠峰，故直接在GC-MS上检索是不可靠的，而采用化学计量学分析则可行。下面以归姜TIC中的A1峰簇(33.524~34.044 min)和鼎药方术归姜TIC中的A2峰簇(33.346~39.106 min)为例(见图2)，对AMWFA法进行阐述。
采用交互移动窗口因子分析法(AMWFA法)[12-13]对2个体系中的2组二维数据片段进行比较分析，最后得到被研究的2组二维数据片段中的共有组分定性结果。该法的主要思路如下：先在一个体系中确定1个目标矩阵X，再利用单点投影法在另一个体系中找到相关的基本矩阵Y，接着利用矩阵X的信息对矩阵Y进行正交投影，从中提取二者中的共有光谱信息。
正交投影矩阵P建立如下：
P=(I-XX+)
其中：I为单位矩阵；X+为X的广义逆。用P对基本矩阵Y沿色谱方向的每条光谱矢量yj进行投影运算：
yjop=Pyj；j=1, 2, …, m
其中：yj和yjop分别为原始光谱和投影光谱；m为y中的色谱最大保留时间扫描点。投影矢量yjop本质上是X的正交互余空间的残差矢量。
考虑到噪声等因素的影响，计算yj和yjop的内积γj，作为判别依据。
图1 药对归姜(AZO)、药对术姜(AZ)、药对术归(AA)和鼎药方术归姜(AAZ)挥发油总离子流图
Fig. 1 TICs of volatile oils from AZO, AZ, AA and AAZ
图2 A1和A2峰簇的总离子流图
Fig. 2 TIC curves of A1 and A2 peak cluster
γj=(yjop)Tyj，0≤γj≤1
将内积γ=(γ1, γ2, …, γj, …, γm)对保留时间或者色谱扫描点作图，即得到光谱相关色谱(MSCC)图。当γj等于0时，yjop与yj完全正交，yjop完全只剩下随机噪声，原始光谱yj与目标矩阵光谱xi高度相关，Y与X中的化学组分完全一致。反过来，将Y作为目标矩阵，X作为基本矩阵进行对比分析，得到反投影多组分光谱相关色谱图(IP-MSCC)。
图3所示为由AMWFA法获得的多组分光谱相关色谱图(MSCC)和反投影多组分光谱相关色谱图(IP-MSCC)。根据该法原理，扫描点20~250区域内曲线与横坐标几乎平行(中间的凸起由噪声引起)，说明A1和A2峰簇互相包含于对方中，所含成分一致。为进一步确定2个体系中的共有组分数，采用AMWFA法进行共有秩分析以确定共有组分数。图4所示为共有秩分析结果。从图4可见：前3个拟合值几乎为0，从第4个开始增大，说明A1和A2 峰簇有3个共有组分。
下面获取这3个共有组分的纯质谱。按照AMWFA 法，在共有组分数为1的区域，可以从其特征向量中获取对应的纯质谱。以A1的色谱峰簇信息为X矩阵，A2色谱峰簇信息为Y矩阵，以X矩阵的5~250扫描区域为基矩阵，用移动窗口技术对Y矩阵中的5~300区域进行扫描(移动窗口数为3)，得到保留时间扫描点与共有组分数关系的共有组分秩图(见图5(a))。在移动窗口扫描过程中，得到各个时间点的质谱和相邻2点质谱的相似度，以相似度和保留时间扫描点作图，得到质谱自相关曲线 (见图5(b))。在共有组分秩图中，有3个共有组分数为 1 的区域(见图5(a)中1，2和3)，其对应的质谱自相关曲线也出现 3个平台(图5(b)中R1，R2和R3)，且相似度几乎为 1。可分别从这 3个平台中任意1点提取出共有组分的纯质谱，即组分1，2和3的质谱。鉴定出3个共有组分分别为(E)-3(10)-蒈烯-2-醇，ε-环香叶烯和香芹酮，其相似度分别为93.77%，96.85%和97.81%。其相应的标准质谱图和解析质谱图分别见图6、图7和图8。
图3 MSCC和 IP-MSCC分析结果
Fig. 3 Results obtained by MSCC and IP-MSCC analysis
图4 共有秩分析结果
Fig. 4 Results of common rank analysis
图5 共有组分解析结果
Fig. 5 Resolution results of common components
图6 (E)-3(10)-蒈烯-2-醇(C10H16O)标准质谱图和解析质谱图
Fig. 6 Standard mass spectrum and resolved mass spectrum of (E)-3(10)-caren-2-ol(C10H16O)
2.2 直观推导式演进特征投影法(HELP)
由于中药的成分十分复杂，其GC-MS的总离子流图谱上有很多重叠峰，直接在GC-MS上进行检索无法获得准确结果，而借助化学计量学中的直观推导式演进特征投影法(HELP)可以获得可靠的分析结果。该方法利用二维矩阵数据包含的色谱/光谱信息，采用局部因子分析以分辨出各组分的纯色谱曲线和光谱, 得到具有真实物理意义的唯一解。该法还具有从背景扣除到满秩分辨一整套分析程序，适合于对未知分析体系直接进行定性定量解析，其最大的优点是能对重叠峰、甚至包峰进行分析，对质谱图进行最大限度地解析[14-18]，其原理见文献[14-15]。该法分析步骤简要如下。
图7 ε-环香叶烯(C9H16)标准质谱图和解析质谱图
Fig. 7 Standard mass spectrum and resolved mass spectrum of epsilon.-cyclogeraniolene(C9H16)
图8 香芹酮(C10H14O)标准质谱图和解析质谱图
Fig. 8 Standard mass spectrum and resolved mass spectrum of D-carvone(C10H14O)
1) 将色谱二维数据矩阵X沿色谱方向分解为一系列相对简单的子体系Xi，检测各个子体系Xi存在的背景与噪声，并扣除背景及噪声。
2) 根据演进特征投影图和特征结构跟踪分析秩图了解各组分的依次流出信息，确定组分数以及各组分的选择性区域和零浓度区域。
3) 利用满秩分辨对各组分的选择性区域和零浓度区域进行分辨，获得各组分的纯色谱和光谱。
4) 将解析所得的各组分纯色谱和光谱乘积线性加并与实际结果进行比较，验证解析结果的可靠性。
图9所示为色谱峰簇B对应的总离子流图，鼎药方术归姜中保留时间段为30.108~30.641 min的峰簇B似乎由3个单峰组成，但在GC-MS上检索相似度不高。图 10所示为峰簇B扣除背景噪音后的秩图，按照HELP原理，有2条特征值曲线(见曲线a和b)明显高于噪声水平，说明有两组分重叠。从图10可以看出：区域1为组分1的纯组分区(组分1流入)，区域1+2为组分1和组分2的混合区(组分2流入)，区域2为组分2的纯组分区(组分1流完)，区域2+3为组分2和组分3的混合区(组分3流入)，区域3为组分3的纯组分区(组分2流完)，区域3+4为组分3和组分4的混合区(组分4流入)，区域4为组分4的纯组分区(组分3流完)。
图9 色谱峰簇B对应的总离子流图
Fig. 9 TIC of B peak cluster
图10 峰簇B扣除背景后的秩图
Fig. 10 EFA plot for B peak cluster after deleting heteroscedastic noise
经过HELP法分析，可知B峰簇是一个四组分体系，解析后的色谱图见图11。由图11可知：最后2个峰几乎相互包含在一起，仅借助质谱库匹配无法获得准确结果。解析得到的化学组分分别为凡伦橘烯、7-二环 [4.1.0]庚烷-7-烯-二环[4.1.0]庚烷、桉烷-4(14),11-二烯和榄香烯，相似度分别为95.065%，92.322%，93.608%和95.121%。
图11 解析后的B峰簇的色谱图
Fig. 11 Resolved chromatograms for B peak cluster
2.3 保留指数
保留指数是目前使用最广泛并被国际上公认的定性分析法，为色谱定性分析的1个重要参数。VANDEN 等[19]定义了程序升温保留指数RI：RI=100n+100[(tx-tn)/ (tn+1-tn)](式中，t为保留时间，x为待分析的化合物的碳原子数，n和n+1分别为正构烷烃的碳原子数)。采用保留指数定性方法，可以使结果更可靠。本文使用的程序升温保留指数计算方法就是基于此公式设计的(恒温部分按此公式计算时误差在允许范围内)。
2.4 鼎药方和药对挥发油组分的定量分析
采用AMWFA鉴定出鼎药方和药对挥发油的共有组分，对重叠峰用HELP进行解析，应用质谱库相似度匹配和计算保留指数，能最大限度且准确地完成四者的化学成分定性。采用总体积积分法可得到各个组分的定量分析结果。分别鉴定出鼎药方、药对归姜、药对术姜和药对术归含有35，73，41和58个组分，分别占挥发油总体积的90.16%，95.56%，92.78%和96.16%。鼎药方鉴定的组分数少于药对的组分数，原因可能在于合煎过程中产生的物理变化和化学反应引起化学成分的种类发生变化。AZO，AZ，AA和AAZ挥发油的主要化学成分见表1。
表1 药对归姜(AZO)、术姜(AZ)、术归(AA)和鼎药方术归姜(AAZ)主要化学成分
Table 1 Main chemical components of volatile oils in AZO, AZ, AA and AAZ
由表1可知药对术归的主要成分为：反式-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(28.68%，体积分数，下同)；3-烯酜内酯(12.80%)；十氢-1,1,7-三甲基-4-亚甲基-1H-环丙基[e]薁(8.24%)；α-蒎烯(4.66%)。药对术姜的主要成分为1-姜烯(20.14%)；1-(1,5-二甲基-4-己烯基)-4-甲基苯(9.65%)；2 -壬酮(10.64%)；3-(1,5-二甲基-4-己烯基)-6-亚甲基-环己烯(9.48%)；药对归姜的主要成分为E-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(10.47%)；正十一烷(14.728%)；1-姜烯(12.20%)；1-甲烯基-4-(1-甲基乙烯基)-环己烷(9.11%)；鼎药方术归姜的主要成分为E-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(32.51%)；3-丁烯酜内酯(12.93%)；十氢-1,1,7-三甲基-4-亚甲基-1H-环丙基[e]薁(8.67%)。从挥发油的组分和体积分数看，鼎药方的主要成分在药对中都能检测出来。
3 结论
1) 鼎药方术归姜中,有5种组分只能在药对归姜中检测出，这5种成分体积分数占鼎药方总体积分数的35.26%。有3种组分只能在药对术归中检测出，这3种成分体积分数占鼎药方总体积分数的3.15%。鼎药方术归姜中，不存在只来自于药对术姜的组分。
2) 鼎药方术归姜中，在药对归姜和药对术归中都能检测出的组分有8种，这8种成分体积占鼎药方总体积的22.55%。在药对术姜和药对术归中都能检测出的组分有6种，这6种成分体积占鼎药方总体积的19.30%。鼎药方术归姜中，没有组分能同时只在药对归姜和药对术姜中检测出。
3) 鼎药方术归姜和3个药对方中共存组分有5种，这5种成分体积占鼎药方总体积的11.37%。
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(编辑 陈灿华)
收稿日期：2017-08-10；修回日期：2017-10-22
基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金资助项目(20175036，20235020) (Projects(20175036, 20235020) supported by the National Natural Science Foundation of China)
通信作者：李晓如，教授，从事天然药物化学研究；E-mail: xrli@csu.edu.cn
