DOI: 10.11817/j.issn.1672-7207.2016.06.006
联用色谱数据结合化学计量学分析紫苏化学成分
张斌1, 2，李晓如1，梁逸曾1
(1. 中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；
2. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙，410004)
摘要：运用GC-MS测定紫苏的叶、梗、子部位中挥发油化学成分，采用交互移动窗口因子法对其共有组分进行比较分析, 结合直观推导式演进特征投影法对重叠峰进行分辨，应用质谱库相似度匹配和计算保留指数对各组分进行定性，采用总体积积分法定量。研究结果表明：紫苏叶、紫苏梗、紫苏子的挥发油分别定性了28，35，38个组分，分别占总量的94.55%，87.91%和89.86%。三者共有6个组分，相对含量之和分别占紫苏叶、紫苏梗和紫苏子挥发油总量的15.26%，16.03%和33.84%。3种药材的挥发油化学组分差异较大，导致三者在药理性上存在一定的差异。
关键词：气相色谱-质谱(GC-MS)；交互移动窗口因子分析法(AMWFA)；直观推导式演进特征投影法(HELP)；紫苏
中图分类号：O629.9 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2016)06-1860-07
Analysis of chemical constituents in perilla frutescens by hyphenated chromatographic data and chemometrics resolution method
ZHANG Bin1, 2, LI Xiaoru1, LIANG Yizeng1
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;
2. Changsha Environmental Protection College, Changsha 410004, China)
Abstract: Analysis of volatile components in Folium Perilla (FP), Caulis Perillae (CP) and Fructus Perillae (FPE) was performed with two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) data coupled with alternative moving window factor analysis (AMWFA) and heuristic evolving latent projections (HELP). The results show that 28, 35 and 38 volatile chemical components in essential oil of FP, CP and FPE are determined qualitatively and quantitatively, accounting for 94.55%, 87.91% and 89.86% total contents of essential oil of FP, CP and FPE, respectively. There are 6 common active constituents among them, accounting for 15.26%, 16.03% and 33.84% total contents of essential oil of FP, CP and FPE，respectively. There is great difference among them in pharmacology.
Key words: gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); alternative moving window factor analysis (AMWFA); heuristic evolving latent projections (HELP); perilla frutescens
中药的化学成分非常复杂，属于未知复杂体系。随着分离以及鉴定技术的发展，使得对中药化学成分的解析成为可能。中药化学成分的获取将为中药的快速发展提供理论依据和数据支持。紫苏(perilla frutescens)既能药用，亦能食用。以茎、叶及子形式入药，分别称苏叶、苏梗、苏子[1]。紫苏叶(Folium Perilla)为唇形科植物紫苏的干燥叶，主治风寒感冒、胸闷、妊娠呕吐。紫苏梗(Caulis Perillae)为唇形科植物紫苏的干燥茎，用于胸膈痞闷、胃脘疼痛、嗳气呕吐、胎动不安。紫苏子(Fructus Perillae)为唇形科植物紫苏的干燥成熟果实，具有降气消痰、止咳平喘、润肠的功效。这些药理方面的差异性与紫苏不同部位药理成分有关。本文作者分别提取紫苏叶、梗、子的挥发性成分，利用GC-MS进行分离检测，采用交互移动窗口因子法(alternative moving window factor analysis，AMWFA)对其共有组分进行比较分析, 结合直观推导式演进特征投影法(heuristic evolving latent projections，HELP)对重叠峰进行分辨，应用质谱库相似度匹配和计算保留指数对各组分进行定性[2-9]，采用总体积积分法定量，对紫苏叶、梗、子进行分析。
1 实验
1.1 仪器和药材
实验仪器为日本岛津QP20l0型气相色谱仪-质谱仪。实验药材包括紫苏叶、紫苏梗、紫苏子，均购于金沙大药房，经湖南中医药研究所鉴定。实验试剂为正构烷烃C8-C20和C21-C40(瑞士Fluka Chemika公司)，正己烷(分析纯)。
1.2 挥发油提取
称取紫苏叶、紫苏梗、紫苏子各50 g，药材与水以体积比1:7混合，按照《中国药典》[10]提取方法来提取。
1.3 正构烷烃参照系和挥发油的测定条件
色谱柱为DB-5(长度×内径为30 m×0.25 mm)。载气为He；流速为1.0 mL/min。进口温度和界面温度均为250 ℃，进样量为0.5 uL，分流比为20:1。程序升温梯度为起始温度40 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至43 ℃，以25 ℃/min升至103 ℃，以2 ℃/min升至116 ℃，以20 ℃/min升至128 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，以8 ℃/min升至230 ℃，维持10 min。EI源电子能量为70 eV，离子源温度为200 ℃。倍增电压为0.8 kV，质荷比扫描范围为35~500，扫描速率为3.8次/s。
1.4 数据分析
数据分析在Gateway T8100计算机上进行，程序用MATLAB 6.5编写，NIST107质谱库进行检索。
2 结果与讨论
2.1 交互移动窗口因子分析法(AMWFA)
交互移动窗口因子分析法[11](AMWFA法)作为化学计量学的一种分析二维数据的方法，其实是多组分光谱相关色谱法[12](MSCC)的拓展，目标是对2个体系中的2组二维数据片段做比较分析，最后得到被研究的2组二维数据片段中的共有组分定性结果。该法的主要思路如下：
先在一个体系中确定一个目标矩阵X，再利用单点投影法在另一个体系中找到相关的基本矩阵Y，接着利用矩阵X的信息对矩阵Y作正交投影，从中提取二者中共有光谱信息。
正交投影矩阵P建立如下：
P=(I-XX+)
其中：I为单位矩阵，X+为X的广义逆。用P对基本矩阵Y沿色谱方向的每条光谱矢量yj进行投影运算：
yjop=Pyj (j=1，2，…，m)
式中：yj和yjop分别表示原始光谱和投影光谱矢量；m为y中的色谱最大保留时间扫描点。投影矢量yjop本质上是X的正交互余空间的残差矢量。
考虑到噪声等因素的影响，计算yj和yjop的内积γj，作为判别依据。
γj=(yjop)Tyj，0≤γj≤1
把所有内积γ=(γ1，γ2，…，γj，…，γm)并对保留时间或者色谱扫描点作图，即得到光谱相关色谱(MSCC)图。当γj=0时，yjop与yj完全正交，yjop完全只剩下随机噪声，原始光谱yj与目标矩阵光谱xi高度相关，Y中的化学组分与X中的完全一致。反之，将Y作为目标矩阵，X作为基本矩阵进行对比分析，得到反投影多组分光谱相关色谱图(IP-MSCC)。
图1所示为紫苏叶、紫苏梗、紫苏子挥发油经GC-MS分离检测得到的总离子流图。紫苏叶和紫苏梗中A1和A2峰簇如图2所示。
图3所示为由AMWFA法获得的多组分光谱相关色谱图(MSCC)和反投影多组分光谱相关色谱图(IP-MSCC)。由图3可知：扫描点20~100区域内曲线与横坐标几乎平行，中间的凸起是噪声引起，说明A1和A2峰簇互相包含于对方中，所含成分一致。为进一步确定2个体系中的共有组分数，采用AMWFA法进行共有秩分析。图4所示为共有秩分析结果。前4个拟合值几乎为0，从第5个开始明显增大，说明A1和A2 峰簇有4个共有组分。
图1 紫苏叶、紫苏梗、紫苏子挥发油总离子流图
Fig. 1 TICs of volatile oils from Folium Perilla, Caulis Perillae and Fructus Perillae
按照AMWFA 法，在共有组分数为1 的区域，可以从其特征向量中获取对应的纯质谱。以A1的色谱峰簇设为X矩阵，A2色谱峰簇设为Y矩阵，以X矩阵的5~140区域为基矩阵，用移动窗口技术对Y矩阵中的5~180区域进行扫描(移动窗口数为4)，建立共有组分秩图(见图5(a))及质谱自相关曲线(见图5(b))。在共有组分秩图中，有4个共有组分数为 1 的区域，其对应的质谱自相关曲线也出现 4个平台(图5(b)中R1，R2，R3和R4所示)，且相似度约为 1。可分别从这 4个平台中任意一点提取出共有组分的纯质谱，即组分 1，2，3和4的质谱。鉴定出4个共有组分分别为3,7-dimethyl-6-Octen-1-ol；9,12-Octadecadienoic acid ethyl ester；Z,Z-8,10-Hexadecadien-1-ol和9,12,15- Octadecatrienal dimethyl acetal，其相似度分别为93.064%，97.954%，95.55%和96.43%。解析后得到峰簇A1和A2的色谱图(见图6)，其为1个五组分重叠形成的峰簇，有4个共有组分。
图2 29.719~30.362 min保留时间段A1峰簇和29.703~30.287 min保留时间段A2峰簇的总离子流图
Fig. 2 TIC curves for A1 peak cluster within 29.719-30.362 min and A2 peak cluster within 29.703-30.287 min
图3 MSCC和IP-MSCC分析结果
Fig. 3 Results obtained by MSCC and IP-MSCC analysis
图4 共有秩分析结果
Fig. 4 Results from common rank analysis
图5 共有组分解析结果
Fig. 5 Analytical results of components
2.2 直观推导式演进特征投影法(HELP)
直观推导式演进特征投影法(HELP)是一种逐步的推导式方法，最大限度地利用了二维色谱数据所包含的化学信息来进行解析。其最大的优点是能对重叠峰进行分析，对质谱图进行最大限度的解析。在此仅给出简要的HELP解析方法，原理和详细步骤见参考文献[13-18]。
图7所示为紫苏梗中保留时间段为22.162~22.417 min的峰簇B，此峰似乎是一单峰，但在GC-MS上检索相似度不高。图 8所示为峰簇B扣除背景噪音后的秩图，按照HELP原理，有2条特征值曲线(见曲线a和b)明显高于噪声水平，说明有2个组分重叠。从图8可知：区域1为组分1的纯组分区(组分1流入)，区域1+2为组分1和组分2的混合区(组分2流入)，区域2为组分2的纯组分区(组分1流完)，区域2+3为组分2和组分3的混合区(组分3流入)，区域3为组分3的纯组分区(组分2流完)，区域3+4为组分3和组分4的混合区(组分4流入)，区域4为组分4的纯组分区(组分3流完)。
图6 解析后的A1峰簇和A2峰簇的色谱图
Fig. 6 Resolved chromatograms for A1 and A2 peak clusters
图7 色谱峰簇B对应的总离子流
Fig. 7 TIC curve for peak cluster B
图8 峰簇B背景扣除后的秩图
Fig. 8 EFA plot for B peak cluster after deleting heteroscedastic noise
经过HELP方法分析可知：B峰簇是一个四组分体系(图9)。化学组分分别为Eudesm-4[14]-en-11-ol，Thunbergol，alpha.-Cadinol和Cyclheptane, 4-methylene- 1-methyl-2-[2-methyl-1-propen-1-vinyl-],相似度分别为95.139%，92.767%，93.083%和94.523%。
2.3 保留指数
VANDEN等[19]定义了程序升温保留指数：
RI=100n+100[(tx-tn)/(tn+1-tn)]
式中：t为保留时间；x为待分析的化合物的碳原子数；n和n+1分别为正构烷烃的碳原子数。本文提出程序升温保留指数计算方法基于此公式(恒温部分按此公式计算时误差在允许范围内)，采用质谱库结合保留指数进行化合物的定性, 结果较传统方法更准确可靠。
2.4 紫苏叶、紫苏梗、紫苏子挥发油组分的定量分析
采用AMWFA鉴定出紫苏叶、紫苏梗、紫苏子挥发油的共有组分，对重叠峰用HELP进行解析，应用质谱库相似度匹配和计算保留指数，最大限度且准确地完成了三者的化学成分定性。采用总体积积分法可得到各个组分的定量分析结果。紫苏叶、紫苏梗和紫苏子分别鉴定出28个、35个和38个组分，分别占挥发油总量的94.55%，87.91%和89.86%。三者挥发油的主要化学成分见表1。
表1 紫苏叶、紫苏梗、紫苏子挥发油的定性和定量分析结果
Table 1 Qualitative and quantitative analysis results of volatile oils in Folium Perillae, Caulis Perillae and Fructus Perillae
图9 解析后的B峰簇的色谱图
Fig. 9 Resolved chromatograms for B peak clusters
3 结论
1) 紫苏叶和紫苏梗挥发油共有组分7个，各组分质量分数之和分别占紫苏叶挥发油总量的1.94%、紫苏梗挥发油总量的2.6%。
2)紫苏叶和紫苏子挥发油共有组分2个，各组分质量分数之和占紫苏叶挥发油总量的1.84%、占紫苏子挥发油总量的0.8%。
3) 紫苏梗和紫苏子挥发油共有组分6个，各组分质量分数之和分别占紫苏梗、紫苏子挥发油总量的1.43%和3.84%。
4) 紫苏叶、紫苏梗和紫苏子挥发油共有组分6个，各组分质量分数之和分别占紫苏叶、紫苏梗和紫苏子挥发油总量的15.26%，16.03%和33.84%。
5) 紫苏叶、紫苏梗和紫苏子挥发油所含化学组分种类及其含量有比较大的差异，导致三者在药理性上存在不同。
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(编辑 赵俊)
收稿日期：2015-06-23；修回日期：2015-09-10
基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金资助项目(20175036，20235020)(Projects(20175036, 20235020) supported by the National Natural Science Foundation of China)
通信作者：李晓如，教授，从事天然药物化学研究；E-mail：xrli@csu.edu.cn
