8种五加属植物根皮中五加酸和贝壳烯酸的

RP-HPLC法定量分析

倪  娜，刘向前，张晓丹

(中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083)

摘  要：建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定五加酸和贝壳烯酸的定量分析方法，利用最优色谱条件对8种中韩五加属植物根皮中的五加酸和贝壳烯酸进行定量分析。研究结果表明，最佳色谱条件为：ODS-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(0~60 min时乙腈含量为10%→100%，60~70 min时乙腈含量为100%)；检测波长为207 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。五加酸和贝壳烯酸线性范围分别为：0.107 0~0.535 1 g/L (相关系数r=0.999 9)和0.093 0~0.464 9 g/L(r=0.999 8)，加样回收率分别为97.93%(标准偏差为1.33%)和98.12%(标准偏差为1.16%)。

关键词：五加属植物；五加酸；贝壳烯酸；RP-HPLC

中图分类号：R284.1；R282.71         文献标识码：A         文章编号：1672-7207(2009)05-1216-06

Determination of acanthoic acid and kaurenoic acid from root

barks of eight kinds of Acanthopanax Miq. Plants by RP-HPLC

NI Na, LIU Xiang-qian, ZHANG Xiao-dan

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Abstract: A RP-HPLC method for quantitative analysis of acanthoic acid and kaurenoic acid was established. The condition of HPLC was optimized. Acanthoic acid and kaurenoic acid from root barks of eight kinds of Acanthopanax Miq. plants were quantitative analysed by the methodology test. The best condition is established as follows: the separation is performed with a ODS-C₁₈ column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) at 30 ℃, and the mobile phase is CH₃CN-H₂O (CH₃CN 10%→100% at 0-60 min, CH₃CN 100% at 60-70 min). The acanthoic acid and kaurenoic acid are detected at 207 nm, the flow rate is 1 mL/min. The liner range of acanthoic acid and kaurenoic acid are 0.107 0-0.535 1 g/L and 0.093 0-0.464 9 g/L, respectively, and give correlations (r) of 0.999 9 and 0.999 8. The recoveries of acanthoic acid ad kaurenoic acid are 97.93%(standard deviation is 1.33%) and 98.12%( standard deviation is 1.16%), respectively.

Key words: Acanthopanax Miq.; acanthoic acid; kaurenoic acid; RP-HPLC

五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax Miq.)植物在全世界已发现有37种，主要分布于北半球的中、韩、日3国。其根皮为民间常见中药，俗称“五加皮”，具有滋补肝肾、抗风湿、抗疲劳、抗肿瘤等功效，临床主要用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软等病症，为中韩两国临床常用的药材之一^[1-4]。药理研究发现，五加皮中的二萜化合物五加酸及贝壳烯酸为其重要的活性成分，被证实具有较好的抗炎和解热镇痛作用，并能保护过氧化氢与四氯化碳造成的肝损伤^[5-7]，新近研究发现，具有抑制肿瘤细胞因子TNF-α、抗IL-1因子和抗HMGB1作用，以及抑制前列腺素E2的合成^[8]，成为了中药和天然药物的研究热点之一。国外Nguyen等^[10] 利用毛细管电泳法分离测定五加属植物中五加酸及贝壳烯酸含量研究^[9]。本文作者利用反相HPLC法建立了五加酸和贝壳烯酸的定量分析方法，并采用方法学进行验证。同时，对8种五加属植物根皮中的这两种二萜成分进行含量测定，以便为制定五加属植物新的质量控制标准和五加皮的临床正确使用提供依据。

1  实验条件

1.1  药材、试剂与仪器

实验选用自采的8种中韩五加属植物，分别为：细柱五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith根皮(产地湖南)，刺五加Acanthopanax senticosus根皮(产地辽宁)，短梗五加Acanthopanax sessiliflorus根皮(产地辽宁)，糙叶藤五加Acanthopanax leucorrhizus (Oliv.) Harms var. fulvescens根皮(产地四川)，红毛五加Acanthopanax giraldii根皮(产地四川)，白毛五加Acanthopanax. divaricatus var. albeofructus根皮(产地韩国)，韩五加Acanthopanax koreanum根皮(产地韩国)，白簕Acanthopanax trifoliatus根皮(产地湖南)。五加酸和贝壳烯酸对照品(纯度≥98%，韩国庆熙大学药学院提供)，结构分别如图1和图2所示。

实验所用试剂为乙腈为色谱纯；色谱分析用水为二次蒸馏水。

实验所用仪器为：LC-10AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司制造)；SPD-10A vp紫外检测器；CBM-102型色谱数据工作站；ODS-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，内径为5 μm)；UV-2100型紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司制造)；AUW-120D型电子分析天平(日本Shimadzu公司制造)；AS 3120A型超声清洗器；RV-S型旋转蒸发仪；TGL-20M型台式高速冷冻离心机。

图1  五加酸结构式

Fig.1　Structure of acanthoic acid

图2  贝壳烯酸结构式

Fig.2　Structure of kaurenoic acid

1.2  色谱条件

色谱柱：ODS-C₁₈反相柱；流动相：A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，时间为0~60 min，B相含量由10%→100%线性变化，时间为60~70 min，B相含量为100%；柱温为30 ℃；灵敏度为0.01；流速为1.0 mL/min；检测波长为207 nm；进样量为10 μL^[10-18]。

2  试验方法

2.1  标准曲线绘制

精确称量五加酸和贝壳烯酸对照品13.4 mg和11.6 mg，分别用MeOH定容至25 mL，超声10 min，配制成质量浓度为0.536 g/L和0.464 g/L的五加酸和贝壳烯酸标准使用溶液。

分别精确吸取上述标准使用溶液2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL置于10 mL容量瓶中，用MeOH定容，作为标准系列混合溶液。在上述色谱条件下，依次进样10 ?L，以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2  样品制备

取细柱五加皮粗粉3.0 g，精确称定。加100 mL正己烷浸泡，超声提取1 h(室温下)，过滤。滤液浓缩并用5 mL MeOH溶解，定容至10 mL，再超声10 min。取上述溶液2 mL离心，静置，取上清液用0.45 ?L微膜过滤后，进样10 μL。

3  结果与讨论

3.1  检测波长的选择

分别精确称取五加酸和贝壳烯酸对照品8.0 mg和7.0 mg，用CHCl₃定容至50 mL。将配制好的混合溶液用紫外线扫描，通过观察样品在波长190~400 nm内的紫外图谱，得到3个最大吸收波长，分别为207，242和254 nm。虽然在207 nm处基线噪声较高，但物质吸收强度较大，故选择207 nm作为HPLC的检测波长，而在242 nm和254 nm处吸收强度过小。

3.2  流动相的选择

在色谱条件优化过程中考察甲醇-水体系、乙腈-水体系以及甲醇-5%磷酸体系、乙腈-5%磷酸体系对色谱分离的影响。结果表明，调节流动相pH值对五加酸和贝壳烯酸的分离影响不大，而乙腈-水体系所得谱图峰形和分离度均比甲醇-水体系的好，所以，选择乙腈-水体系作为流动相。由于五加酸和贝壳烯酸互为同分异构体，很难分离，因此，采用线性梯度洗脱方式进行分离。在0~60 min内比较多个梯度乙腈10%→30%，10%→50%，10%→80%和10%→100%)，最后确定以10%乙腈-水为起始流动相，在60 min内乙腈由10%递增到100%，对细柱五加皮样品各组分的分离效果较好，分离度达到色谱分析的要求(如图3所示)。五加酸和贝壳烯酸标准品及细柱五加皮样品的色谱图如图4所示。

3.3  线性关系考察

将逐级稀释的标准系列溶液分别进样10 μL，分别计算五加酸和贝壳烯酸的回归方程(n=6)，所得五加酸的回归方程为：A=3 421 999.98X-1 583.58，r=0.999 9。结果表明，五加酸在0.107 0~0.535 1 g/L范围内线性关系良好。

贝壳烯酸的回归方程为：A=3 838 853.49X-9 508.41, r=0.999 8。结果表明，贝壳烯酸在0.093 0~0.464 9 g/L范围内线性关系良好。

图3  线性梯度洗脱色谱图

Fig.3  Linear gradient elution chromatogram

(a) 五加酸标准品；(b) 贝壳烯酸标准品；(c) 样品

图4  五加酸和贝壳烯酸标准品和样品的高效液相色谱图

Fig.4  HPLC chromatograms of acanthoic acid and kaurenoic acid standard and test samples

3.4  精密度试验

精确吸取0.536 g/L和0.464 g/L五加酸和贝壳烯酸对照品溶液，按照上述色谱条件测定，连续进样3次，每次10 ?L，记录五加酸和贝壳烯酸的峰面积，平均值分别为1 838 778.5和1 760 693.2，标准偏差(RSD)分别为0.21%和0.43%(n=3)。

3.5  重现性试验

取细柱五加皮粗粉5份，每份3.0 g，精密称定，按照样品溶液制备方法平行制备，在上述色谱条件下依次进样10 ?L，计算五加酸和贝壳烯酸含量平均值分别为0.056 80%和0.140 67%，RSD分别为0.44%和0.57%。

3.6  稳定性试验

取同一份细柱五加皮样品溶液在室温下放置，在上述色谱条件下分别于0，3，6，9 h进样，每次10 ?L，测定五加酸和贝壳烯酸的峰面积，其平均值分别为584 282.4和1 616 378.1，RSD分别为1.18%和1.05%，表明五加酸和贝壳烯酸在9 h内稳定性良好。

3.7  回收率试验

采用加样回收率法，精确称量已知含量的细柱五加皮粗粉6份，每份约2.0 g，分别加入0.32 g/L和0.28 g/L五加酸和贝壳烯酸对照品溶液1.5，1.5，3.0，3.0，4.5，4.5 mL，按照样品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下依次进样10 ?L，记录色谱峰，五加酸低、中、高3种加入量的回收率(n=3)分别为97.89% (RSD为1.02%)，98.40% (RSD为1.55%)，97.49% (RSD为1.41%)，平均回收率为97.93%，RSD为1.33%；贝壳烯酸低、中、高3种加入量的回收率(n=3)分别为97.34% (RSD为1.29%)，98.91% (RSD为1.05%)，98.12% (RSD为1.15%)，平均回收率为98.12%，RSD为1.16%。具体数据见表1和表2。

表1  五加酸回收率测定结果

Table 1　Experimental results of acanthoic acid recovery

表2  贝壳烯酸回收率测定结果

Table 2　Experimental results of kaurenoic acid recovery

3.8  8种五加属植物根皮的含量测定

制备8种中韩五加属植物根皮的供试液，分别精确量取各样品供试液，以五加酸和贝壳烯酸标准溶液为对照，在上述色谱条件下对8种药材进行定量分析，分别进样3次，得8种药材五加酸和贝壳烯酸的含量，结果如表3所示。

由表3可知，韩五加、白簕和细柱五加中均含有五加酸和贝壳烯酸，短梗五加和白毛五加中含有的五加酸和贝壳烯酸的含量低于0.01%, 其中，韩五加中五加酸含量最高，为0.854%；贝壳烯酸在白簕中含量最高，为1.042 15%。而在红毛五加、刺五加和糙叶藤五加中未能检测到这2种二萜成分。采用RP-HPLC法对8种中韩五加植物根皮中二萜成分定量，结果与文献[9]中报道的毛细管电泳法测定的结果几乎一致。白簕和刺五加可能因为产地原因或采收时间不同，导致所测五加酸以及贝壳烯酸的含量有差别。

表3  8种五加属植物根皮中二萜成分含量测定结果(n=3)

Table 3　Analytical results of diterpene from eight kinds of Acanthopanax Miq. plants root bark (n=3)

4  结  论

a. 建立了反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定五加酸和贝壳烯酸的定量分析方法，优化并确定了最佳色谱条件：检测波长为207 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，流动相为乙腈-水(0~60 min内乙腈含量由10%→100%，在60~70 min内乙腈含量为100%)。经方法学验证，仪器精密度、试验稳定性、方法重现性及加样回收率都达到中药色谱分析要求。结果证明该方法简便快捷，准确性高，适用于抗炎二萜五加酸和贝壳烯酸的分离定量。

b. 对8种中韩五加属植物根皮的二萜成分五加酸和贝壳烯酸进行含量测定，结果表明，细柱五加、韩五加、白簕、短梗五加和白毛五加中均含有五加酸和贝壳烯酸，而在红毛五加、刺五加和糙叶藤五加中没有检测到。从含量分析来看，五加酸及贝壳烯酸成分存在于花椒五加组和头序五加组中，在其他五加属植物中未检出。本实验建立的五加酸定量分析方法，可作为花椒五加组和头序五加组专属检测及分类学鉴定的有效方法，为制定一种五加属植物新的质量控制标准和优化植物资源提供了实验依据。

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收稿日期：2008-08-11；修回日期：2008-11-04

基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目([2005]55)

通信作者：刘向前(1967-)，男，湖南长沙人，博士，副教授，从事中药及天然药物活性成分研究、中药单复方制剂研究；电话：0731-88995848；E-mail: lxq0001cn@yahoo.com.cn