文章编号：1004-0609(2016)-07-1547-05
锰离子浓度对氧化亚铁硫杆菌生长动力学的影响
滕 青1, 2，冯雅丽1，李浩然2，张 旭1, 2
(1. 北京科技大学 土木与环境工程学院，北京 100083；
2. 中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190)
摘 要：考察不同初始ρ(Mn2+)条件下，氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)培养体系中Fe2+浓度的变化曲线和A.ferrooxidans菌的生长活性。结果表明：A.ferrooxidans菌对Mn2+具有一定的耐受能力；当培养基中ρ(Mn2+)≤1 g/L时，Mn2+对A.ferrooxidans菌生长活性影响很小；ρ(Mn2+)为5~15 g/L时，A.ferrooxidans菌生长开始受到抑制；ρ(Mn2+)=20 g/L时，A.ferrooxidans菌生长完全受到抑制。为了进一步描述Mn2+对其生长活性的影响，利用[Fe2+]/[Fe3+]的比值及A.ferrooxidans菌对Fe2+的得率系数对不同Mn2+浓度下细菌的比生长速率进行拟合，较好地描述Mn2+浓度对氧化亚铁硫杆菌生长的影响。
关键词：氧化亚铁硫杆菌；生物浸锰；生长动力学；比生长速率
中图分类号：Q935 文献标志码：A
近年来，氧化亚铁硫杆菌等细菌被广泛应用于低品位、难处理锰矿和铜矿的细菌浸出[1-2]。菱锰矿细菌浸出主要是利用氧化亚铁硫杆菌把硫酸亚铁氧化为酸性硫酸高铁溶液，然后在一定条件下利用高铁溶液浸出菱锰矿。软锰矿浸出过程中高价MnO2需经还原剂还原为Mn2+，二氧化硫、硫酸亚铁、双氧水、铁粉和有机物类等均可作为软锰矿浸出还原剂[3-5]。 氧化亚铁硫杆菌浸出软锰矿的研究中，通常以黄铁矿为还原剂[6-7]。
氧化亚铁硫杆菌的生长特性关系其浸矿能力，从自然界分离得到的氧化亚铁硫杆菌存在对亚铁氧化活性低的缺点，研究人员对各种离子影响氧化亚铁硫杆菌活性方面进行较为深入的研究。嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长所需的Fe2+和Mg2+等营养离子，其浓度并非越高越好, 只有在某个浓度条件下氧化亚铁硫杆菌的活性最高[8-9]。Ni2+、Co2+、Cu2+、U6+等重金属离子对氧化亚铁硫杆菌具有一定的毒性，抑制其对金属硫化矿的浸出，可采用驯化、诱变育种、基因工程等方法改良菌种得到耐受高浓度重金属离子的菌种[10-11]。Ag+、Hg2+、Bi3+、Co2+等在一定范围内可催化氧化亚铁硫杆菌的浸出，但浓度太高，则对细菌生长起抑制作用，降低浸出效率[12]。不同的阴离子对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长动力学有明显影响，其中SO42-影响较Cl-和NO3-强[13-14]。在锰矿浸出时，锰离子随浸出过程的进行而溶解，可能对氧化亚铁硫杆菌的生长及活性产生影响。然而，尚未见文献报道锰离子对氧化亚铁硫杆菌生长活性的影响及锰离子浓度对氧化亚铁硫杆菌生长动力学影响。
本文作者监测不同锰离子浓度下氧化亚铁硫杆菌的生长过程，利用[Fe2+]/[Fe3+]的比值及氧化亚铁硫杆菌对Fe2+的得率系数拟合细菌在不同Mn2+浓度下的比生长速率，确定在不同锰离子浓度下的细菌生长动力学参数，进而优化氧化亚铁硫杆菌的培养条件。
1 实验
1.1 A.ferrooxidans菌培养条件
本实验所用菌种为A.ferrooxidans菌(氧化亚铁硫杆菌)，实验室保藏。Mn2+采用无水MnSO4(化学纯)配置。
培养方法：取100 mL配置好的培养液于250 mL锥形瓶中，接种量为20%，置于(30±0.5) ℃ SZX-B型恒温水浴振荡摇床内，震荡速度设为120 r/min，培养时间为4 d。溶液的氧化还原电位(Eh)和溶液pH值用DZS-707型多参数分析仪进行测定，同时测定溶液中Fe2+浓度，定期补加蒸馏水弥补因蒸发而损耗的水分。
1.2 主要仪器和分析方法
主要仪器：紫外-可见分光光度计(UV-1750型分光光度计，SHIMADZU)；pHS-29A型酸度计；DZS-707型多参数分析仪；SZX-B型恒温水浴振荡摇床。
分析方法：溶液氧化还原电位由DZS-707型多参数分析仪测定；采用邻菲罗啉分光光度法测定Fe2+和总铁的浓度([FeT])，即[Fe3+]=[FeT]-[Fe2+](mg/L)。
2 结果与讨论
2.1 不同Mn2+浓度下氧化亚铁硫杆菌生长过程中代谢变化
通过改变溶液中Mn2+浓度(0.1、1、5、10、15和20 g/L)，研究A.ferrooxidans菌生长过程的代谢变化情况，当培养基中总Fe浓度为9 g/L时，Fe2+浓度随时间的变化曲线如图1所示。同时，为了排除总Fe浓度对A.ferrooxidans菌生长过程中代谢变化的影响，在培养基中总Fe浓度为6 g/L时，考察不同Mn2+浓度(0.1、1、5、10、15和20 g/L)下Fe2+浓度随时间的变化，变化曲线如图2所示。
图1 总Fe浓度为9 g/L时不同Mn2+浓度下Fe2+浓度随时间的变化曲线
Fig. 1 Variation of Fe2+ concentration with time at different Mn2+ concentrations and total iron concentration of 9 g/L
图2 总Fe浓度为6 g/L时不同Mn2+浓度下Fe2+浓度随时间的变化曲线
Fig. 2 Variation of Fe2+ concentration with time at different Mn2+ concentrations and total iron concentration of 6 g/L
从图1和2中可看出，当培养基中总Fe浓度分别为9 g/L和6 g/L时，无菌条件下，由于Mn2+的加入对Fe2+的氧化并无影响，不考虑Mn2+影响的条件下，Fe2+几乎不被氧化；有菌条件下，培养液中的Mn2+对细菌生长均不利，且对细菌生长活性的影响规律相同，Mn2+浓度越大，抑制作用越大。当ρ(Mn2+)≤1 g/L时，Mn2+对细菌生长活性影响很小，不影响细菌的生长繁殖；随着Mn2+浓度增加，对细菌生长繁殖的影响逐渐明显；当溶液中Mn2+浓度升至15 g/L时，细菌生长明显延迟；当溶液中Mn2+浓度升至20 g/L时，细菌代谢完全停止，菌体大量死亡。
2.2 不同Mn2+浓度下溶液氧化还原电位的变化
实验分别在不同Mn2+浓度(0.1、1、5、10、15和20 g/L)下测量了溶液的氧化还原电位，其结果如图3所示。细菌在生长过程中，溶液中主要发生的反应 如下：
(1)
(2)
通过能斯特方程计算溶液的氧化还原电位(φh)，见式(2)。随着细菌的生长，溶液中的Fe2+在细菌的氧化作用下失电子变为Fe3+，使[Fe3+]/[Fe2+]比值增加，溶液氧化还原电位φh上升[8, 15]。由图3可知， Mn2+对溶液中的最大氧化还原电位无影响，但ρ(Mn2+)≤ 1 g/L时，溶液氧化还原电位在48 h内达到700 mV，表明Mn2+对细菌的活性影响很小，细菌生长旺盛；当Mn2+浓度从5 g/L增加到15 g/L时，溶液氧化还原电位在72~96 h时才达到700 mV。这与图2结果相符，随着溶液中Mn2+浓度的增加，A.ferrooxidans菌的代谢受到抑制，进而降低了Fe2+的氧化能力，溶液中Fe2+积累，[Fe3+]/[Fe2+]的值降低，φh值减小。
图3 总Fe浓度为6 g/L的条件下不同Mn2+浓度对溶液氧化还原电位的影响
Fig. 3 Effect of different Mn2+ concentrations on culture solution oxidation reduction potential at total iron concentration of 6 g/L
2.3 不同Mn2+浓度对溶液pH的影响
实验在Mn2+浓度为0~15 g/L范围内考察溶液pH的变化情况，其结果如图4所示。图4表明，在前30 h内，Mn2+浓度越大，溶液pH越小；30 h后，Mn2+浓度越大，溶液pH越大。这是由于培养初期，Fe2+被A.ferrooxidans菌氧化的过程中耗酸，致使溶液pH升高，而Mn2+浓度越大，细菌氧化Fe2+的能力越低，所以溶液pH越小；后期，溶液pH出现明显下降，这是由于随着培养时间的延长，溶液中Fe3+离子的量逐渐增多，而Fe3+离子的水解、黄铁矾类物质的生成，如式(3)所示，都会产生H+，致使溶液pH下降[16]。
图4 不同 Mn2+浓度下溶液中的pH随时间的变化
Fig. 4 Variation of pH with time at different Mn2+ concentrations
(3)
2.4 氧化亚铁硫杆菌生长动力学参数的计算
在细菌培养的对数生长阶段，虽然培养基中的营养成分发生了变化，但细胞数目随时间呈指数条件增加，且细胞中各组分以相同速率增加，细胞平均组分近似恒定，故细菌的生长速率并不变。以细胞数量的增加表示生长速度为
(4)
t=0时，X=X0，
(5)
假设细菌对Fe2+的得率系数
为以常数，于是
(6)
将式(3)代入式(2)，两边取对数得
(7)
式中：[Fe2+]0为培养液初始Fe2+浓度，mg/L；
为t时刻Fe2+浓度，mg/L；X为细菌浓度，个/mL；为细菌对Fe2+的得率系数，个/g；μ为细菌的比生长速率，h-1；t为培养时间，h。
由式(7)可知，以
对培养时间作图，选择其中连续的线性关系最好的点拟合而得一次的函数的斜率即为细菌的比生长速率μ，如图5所示。
由图5可得到不同Mn2+浓度条件下细菌的比生长速率及进入对数期的时间，所得数据见表1。由表1可知，Mn2+浓度越大，细菌的比生长速率越小，进入对数期的时间越久。这是由于随着Mn2+浓度的增加，细菌对环境的适应性越弱，迟缓期越长。
图5 不同Mn2+浓度条件下ln([Fe2+]0-[Fe2+]t)随时间的变化
Fig. 5 Variation of ln([Fe2+]0-[Fe2+]t with time at different Mn2+ concentrations
表1 不同Mn2+浓度条件下氧化亚铁硫杆菌比生长速率的比较
Table 1 Comparison of specific increase rate of A.ferrooxidans at different Mn2+ concentrations
3 结论
1) 考察了在不同Mn2+浓度下，氧化亚铁硫杆菌生长过程中Fe2+浓度、pH、φh随时间的变化，结果表明：氧化亚铁硫杆菌对Mn2+具有一定的耐受能力；当培养基中ρ(Mn2+)≤1 g/L时，Mn2+对细菌的生长活性影响很小；ρ(Mn2+)为5~15 g/L时，细菌生长出现延迟；当ρ(Mn2+)增大到20 g/L时，细菌代谢完全受到抑制，细菌大量死亡。随着Mn2+浓度的不断增加，溶液氧化还原电位逐渐减小，pH逐渐增大。
2) 利用[Fe2+]/[Fe3+]的比值及细菌对Fe2+的得率系数拟合了细菌在不同Mn2+浓度下的比生长速率，较好地描述了Mn2+浓度对氧化亚铁硫杆菌生长的影响。当ρ(Mn2+)≤1 g/L时，Mn2+不影响细菌进入对数期的时间，但是细菌的比生长速率减小；当Mn2+浓度为5~15 g/L时，细菌进入对数期的时间延迟，比生长速率也随着Mn2+浓度的增加而减小。
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Effect of manganese ion concentration on growth kinetics of Acidithiobacillus ferrooxidans
TENG Qing1, 2, FENG Ya-li1, LI Hao-ran2, ZHANG Xu1, 2
(1. School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China;
2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)
Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans (A.ferroxidans) can be used for microbial leaching of manganese oxide, the impact of the different initial Mn2+ concentration on the activity of the growth of A.ferrooxidans was studied, and the bacterial growth and activity were obtained at different manganese ion concentrations. The results show that A.ferrooxidans is tolerant to Mn2+ some extent. The effect of Mn2+ on the growth and activity of A.ferrooxidans by Mn2+ is not bad when A.ferrooxidans are cultured in medium containing ρ(Mn2+)≤1 g/L. The growth and activity of A.ferrooxidans are obviously influenced by Mn2+ when ρ(Mn2+) is 5-15 g/L. When the concentration of Mn2+ is around 20 g/L, the growth and activity of A.ferrooxidans are completely inhibited. In orden to further describe the impact of Mn2+ on growth activity of A.ferrooxidans, [Fe2+]/[Fe3+] and the yield coefficient of Fe2+ on the specific growth rate of A.ferrooxidans in different concentrations of Mn2+ were fitted, the effect of Mn2+ concentration on the growth of A.ferrooxidans was described better.
Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; biological leaching manganese; growth kinetics; specific growth rate
Foundation item: Project(21176026, 21176242) supported by the National Natural Science Foundation of China; Project (DY125-15-T-08) supported by the China Ocean Mineral Resources Research & Development Program, China; Project(FRT-TP-09-002B) supported by Fundamental Research Funds for the Central Universities of China
Received date: 2015-04-19; Accepted date: 2016-01-12
Corresponding author: FENG Ya-li; Tel: +86-10-62311181; E-mail: ylfeng126@126.com
(编辑 李艳红)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(21176026，21176242)；中国大洋矿产资源研究开发计划(DY125-25-T-08)；中央高校基础研究基金资助项目(FRT-TP-09-002B)
收稿日期：2015-04-19；修订日期：2016-01-12
通信作者：冯雅丽，教授，博士；电话：010-62311181；E-mail：ylfeng126@126.com
