DOI： 10.11817/j.issn.1672-7207.2021.05.003

修复钒镉复合污染水体的菌株分离及性能

林海^{1, 2}，李真^{1, 2}，董颖博^{1, 2}，李冰^{1, 2}，贺银海^{1, 2}

(1. 北京科技大学 环境工程系，北京，100083；

2. 北京科技大学 工业典型污染物资源化处理北京市重点实验室，北京，100083)

摘要：从受重金属钒镉污染的土壤中筛选出抗性菌株并对其生理生化性质进行研究，考察菌株对钒镉重金属污染水体的修复效果，并对其吸附机理进行分析。研究结果表明：对水体修复效果较好的4株菌均为革兰氏阴性菌，在甲基红试验、蔗糖和葡萄糖产酸试验中，菌株VCR01，VCR02和VCR04呈阳性，而VCR03呈阴性；4株菌中，菌株VCR02对液体培养基中重金属钒镉的修复效果最好，经16S rRNA序列鉴定其为芽孢杆菌菌属；当钒初始质量浓度为200 mg/L、镉初始质量浓度为5 mg/L、温度为30 ℃时，该菌株对2种重金属去除效果最佳，pH为6时，钒去除率最高达38.23%，pH为7时，镉去除率最高达44.15%；菌株VCR02通过物理吸附去除重金属，菌体表面的磷酸基团、酰胺基团、氨基是其吸附重金属钒镉离子的主要基团。

关键词：钒；镉；复合污染水体；重金属吸附；微生物修复

中图分类号：X522            文献标志码：A              开放科学(资源服务)标识码(OSID)

文章编号：1672-7207（2021）05-1418-09

Isolation and characterization of bacteria for vanadium and cadmium polluted water remediation

LIN　Hai^{1, 2}, LI　Zhen^{1, 2}, DONG　Yingbo^{1, 2}, LI　Bing^{1, 2}, HE　Yinhai^{1, 2}

(1. Department of Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China;

2. Beijing Key Laboratory on Resource-Oriented Treatment of Industrial Pollutants, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China)

Abstract: The resistant strains were screened from the soil contaminated by vanadium and cadmium. The repair effect of strains on vanadium and cadmium contaminated water was investigated. Meanwhile, the mechanism of adsorption was studied. The results show that the four strains with good remediation effect are all Gram-negative bacteria. The Methyl red test, sucrose and glucose acid production tests are positive for strain VCR01, VCR02 and VCR04, whereas they are negative for VCR03. Among the sieve, strain VCR02 has the best repair effect,which is identified as Bacillus. The highest efficiencies of the removal of two heavy metals are achieved when the temperature is 30 ℃ and initial mass concentrations of vanadium and cadmium are 200 mg/L and 5 mg/L, respectively. The vanadium removal rate is the highest at pH 6 (38.23%), while the cadmium removal rate is the highest at pH 7 (44.15%). The phosphate group, the amide group and the amino group on the surface of the cell are the main adsorption groups.

Key words: vanadium; cadmium; compound polluted water; heavy metal adsorption; bioremediation

近年来，国内工业飞速发展，矿山开采、金属冶炼等行业向水体中排放多种重金属，造成了严重的复合重金属污染。攀钢集团在钒生产过程中每年产生提钒废水约8.5万t，其中V和Cr浓度超过排放标准几十到几百倍、甚至上千倍^[1]；攀枝花巴关河渣场附近浅层地下水V质量浓度超过饮用水源地标准(50 μg/L)近300倍，Cd质量浓度超过国家地下水质量标准Ⅴ类(0.01 mg/L)近4倍^[2-4]。镉是有毒重金属，为生物生长非必需元素；微量钒对生物体有益，但其化合物毒性随钒的价态升高而增大，对生物有害^[5]。重金属在食物链中层层积累，位于顶端的人类深受其害^[6]。

较为传统的水体中重金属污染治理方法有化学沉淀法、电化学法、吸附法和膜分离法等，但均存在一定的局限性，如化学沉淀会产生二次污染、电化学法耗电量巨大、膜分离法价格昂贵等^[7]。近年来，微生物吸附法的研究十分热门，细菌已被认为是用于金属修复的最重要的生物吸附剂之一^[8]。微生物法有操作简便、经济实惠等优点，且在处理低浓度重金属废水方面具有良好的发展前景^[9-12]。通过向培养基中加入高浓度重金属，可以分离得到自然界中对该种重金属有一定修复潜力的菌株^[13]。LIMCHAROENSUK等^[14]向营养肉汤中加入重金属，在泰国锌矿土壤样品中筛选出3株对重金属有吸附能力的菌，对Cd²⁺和Zn²⁺的去除率分别可达74.2%和78.3%。

微生物对重金属污染起到修复作用主要是利用加入水中的微生物菌体进行吸附。若加入菌体为活细胞，则主要为以下3个过程：1) 在细胞表面吸附；2) 微生物分泌胞外聚合物(EPS)与重金属离子结合；3) 依赖代谢的生物积累^[15]。去除过程若不依赖于细胞的新陈代谢，则静电吸附起到很重要的作用，菌体表面的基团与金属离子互相吸引达到吸附的效果；若依赖于细胞的新陈代谢，细菌则会将重金属转运至细胞内积累，在代谢过程中还可能会对重金属进行价态的改变。将钒的价态降低再进行沉淀是有前景的修复策略^[16]。YELTON等^[17]研究表明：五价钒被微生物吸收后可以通过其电子传递进行还原，也可通过其他电子受体的还原酶作用还原为四价钒并沉淀，在钒污染的地下水中加入乙酸盐，钒去除率可以达到99%。

目前，研究者多对单种重金属进行治理，针对重金属钒镉复合污染水体微生物修复的研究较少。基于此，本文作者从受重金属污染的土壤中筛选出对V和Cd具有修复效果的菌种，通过条件优化实验得到该菌种在水体钒镉污染修复中最佳的应用条件，通过傅里叶转换红外线光谱分析得到在重金属去除过程中发挥重要作用的官能团，以期为微生物处理重金属污染水体提供借鉴。

1  材料与方法

1.1　菌种来源及培养基

受钒和镉污染的土壤采自湖北省某石煤钒矿冶炼厂周边土壤(V和Cd的质量分数分别为1 171.0×10^-6和1.52×10^-6)，从该土壤中进行菌株分离。试验中，以LB培养基为基础培养基，加入CdCl₂·2.5H₂O及NaVO₃，配置成重金属元素质量浓度为10 g/L的重金属储备液作为选择培养基；选用休和利夫森二氏培养基、甲基红培养基、淀粉培养基用于菌株的生理生化性质鉴定试验。

1.2　主要仪器

采用冷冻离心机(湖南平凡科技有限公司生产)进行细菌培养液固液分离；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(中国科学院生态环境研究中心生产)测定重金属质量浓度；采用冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司生产)冷冻干燥离心所得菌体，以便进行傅里叶红外光谱测定。

1.3　试验方法

1.3.1　菌种的筛选及鉴定　

采用涂布平板法在含有10 mg/L Cd(Ⅱ)和100 mg/L 的土壤上清液中选择培养耐钒、镉菌种，划线培养单个菌落并纯化4代；将所得菌株接种于含有10 mg/L Cd(Ⅱ)和418 mg/L 的LB培养基中培养24 h，测定剩余重金属质量浓度，得到具有修复能力的菌株^[18]。

对所筛选出的菌株进行生理生化性质实验^[19]，包括革兰氏染色、甲基红试验、葡萄糖产酸试验、蔗糖产酸试验、淀粉水解试验和质量浓度0.1 g/mL NaCl生长试验；由南京思普金生物科技有限公司对效果最佳的株菌进行分子生物学鉴定，所得序列结果在EzTaxon中进行分析比对，调取与之同源性较高的菌种16S rRNA序列构建系统发育树。

1.3.2　菌株的应用条件优化　

按照燕传明等^[20]所用试验方法并在其基础上进行修改，将具有修复能力的菌株活化后加入含有10 mg/L Cd(Ⅱ)和300 mg/L 的LB液体培养基中，测定不同培养时间下剩余重金属质量浓度，得到最佳吸附时间；考察不同钒初始质量浓度、镉初始质量浓度、温度、pH对菌株去除2种重金属效果的影响，通过单因素试验确定最佳应用条件。

1.3.3　菌体的红外吸收光谱研究　

取重金属吸附前后菌液各50 mL，离心后将菌体进行冷冻干燥，由北京中科百测技术服务有限公司测定菌体的傅里叶转换红外光谱。

2  结果与讨论

2.1　菌种的筛选及鉴定

从土壤中共分离出10株菌落形态各不相同的菌株，进一步经含有钒、镉的培养基摇瓶培养后，筛选并纯化出4株去除效果良好的菌，其生理生化性质如表1所示。从表1可见，4株菌均为革兰氏阴性菌。有研究表明革兰氏阴性菌细胞表面含有脂多糖，且带有负电性，能够吸附重金属阳离子，有利于重金属修复^[20]，株菌VCR01，VCR02和VCR04为发酵型，隔绝氧气的情况下能够利用葡萄糖、蔗糖产生有机酸，在实际应用中，较深层水体中含氧量较低，发酵型菌株能使环境中pH降低，导致细菌表面的官能团质子化，从而会促进阴离子金属物质的吸附过程，这对水中的去除有良好效果^[15]。

表1　菌株菌落形态及生理生化性质

Table 1　Colony morphology and physiological and biochemical properties of screened bacterial

4株菌的重金属去除效果如图1所示。从图1可知：4株菌对重金属的去除率均在38%以上；细菌去除重金属能力从大到小依次为VCR02，VCR04，VCR01，VCR03。由于重金属毒性、菌株吸附机理的不同，许多研究者证明同一菌株对不同重金属的去除效果也会存在差异^{[14, 20]}。从图1还可以看出：菌株VCR03对V和Cd的去除率均不高，分别为25.74%和13.24%，其原因是细菌表面所带基团可能不利于重金属吸附，同时还可能与其自身不能产酸有关^[21]；菌株VCR01对V的去除率达到32.58%，对Cd的去除率仅为19.22%，表明该菌株对V有较好的修复效果；菌株VCR04则正好相反，能够去除45.05%的Cd，而V的去除率却仅有23.26%；菌株VCR02对V的去除率达38.00%、对Cd的去除率达47.15%，且菌液变蓝，证明在微生物生长过程中还原了。

图1　筛选菌株对重金属V和Cd的去除率

Fig. 1　Removal rate of heavy metals V and Cd by screening strains

对菌株VCR02进分子生物学鉴定，将16S rRNA序列在EzTaxon中进行分析比对，该菌株最大与Bacillus toyonensis有99.79%的同源性。选取同源性相近的菌株构建菌株VCR02的系统发育树，结果表明菌株VCR02与Bacillus fungorum距离较近，可以判断其属于芽孢杆菌菌属，系统发育树如图2所示。

图2　菌株VCR02系统发育树

Fig. 2　Phylogenetic tree of strain VCR02

2.2　菌种的应用参数对重金属去除效果的影响

2.2.1　吸附时间对重金属去除率的影响　

菌株在培养0~48 h的生长曲线及对重金属的去除率如图3所示，图中，吸光度在600 nm波长处测得。从图3可以发现：随着生长时间的延长，2种重金属的质量浓度均呈下降趋势。在培养基pH小于7的酸性环境下，细菌表面的基团会发生质子化，与负离子()相吸引^[15]，因此，在接种菌液后的短时间内V剩余质量浓度迅速下降。在细菌生长过程中，大量V被还原^[22]，在此阶段内，H⁺与Cd²⁺竞争结合位点^[23]，故Cd质量浓度未有明显变化。培养11 h时，菌液中V的质量浓度基本趋于稳定，此时菌液的颜色微微变蓝。ORTIZ-BERNAD等^[24]发现细菌可以通过耦合有机物的氧化获得生长能量化合物还原，作为电子受体被还原到4价，存在形式可能为氧钒离子(VO²⁺)；Cd的质量浓度也呈对数降低，因为此阶段细菌的生物量变大，其表面大多数基团(羧基、巯基、磷酰基等)可以与Cd²⁺进行结合^[15]，达到去除重金属的效果。在培养24 h时，2种菌的菌液均已明显变为蓝绿色，V的剩余质量浓度趋于稳定，达到33.20%的去除率，Cd剩余质量浓度降低至基本不变，去除率为30.73%。HUANG等^[23]发现：细菌在吸附重金属过程中，已经吸附的重金属离子也会再脱附。从图3也能看出：吸附24 h后，镉浓度有所回升，综合分析认为，菌株VCR02对2种复合重金属的最佳吸附时间为24 h。

图3　细菌生长量和重金属剩余质量浓度随时间变化

Fig. 3　Bacterial growth and residual mass concentration of heavy metals over time

2.2.2　钒初始质量浓度对重金属去除率的影响　

钒初始质量浓度对重金属去除的影响如图4所示。从图4可知：随着加入量增大，钒的去除率上升，在钒初始质量浓度200 mg/L的条件下，去除率最大，达到34.15%；但钒的质量浓度对自身的去除无太大影响。这可能是因为去除培养基中的不是单纯地依靠吸附作用，而是首先要对进行还原，但细菌的生长量有限，能够转移的电子也有限，从而限制去除率的提高。

图4　钒初始质量浓度对重金属去除率的影响

Fig. 4　Effects of V mass concentration on removal rate of heavy metals

钒初始质量浓度对于镉的去除有较明显的影响，质量浓度为50 mg/L时，镉的去除率最高，达到53.63%，随着钒初始质量浓度的增加，去除率下降。这可能是因为大量在进入液体后，细菌表面基团质子化，占据了原本能够与Cd²⁺结合的位点，导致镉吸附量下降。

2.2.3　镉初始质量浓度对重金属去除率的影响　

在钒初始质量浓度为200 mg/L时，镉初始质量浓度对重金属去除率的影响如图5所示。从图5可见：当Cd²⁺初始质量浓度为10 mg/L时，Cd的去除率最高，达44.91%；当Cd²⁺初始质量浓度为15 mg/L时，V去除率最高，达到40.27%。在Cd初始质量浓度为5 mg/L时，2种重金属去除率最高，V去除率达38.23%，Cd去除率达44.15%。

图5　镉初始质量浓度对重金属去除率的影响

Fig. 5　Effects of Cd mass concentration on removal rate of heavy metals

Cd²⁺的吸附主要靠胞外吸附^[23]，污染物浓度增大能够提高吸附推动力，一定程度上能增大去除率，这与李兰松等^[25]得到的试验结果相同，而Cd²⁺的去除占据了质子化后能与VO₃^-结合的基团，故Cd的去除率降低才能使V的去除率升高。

镉具有毒性，浓度过高会对微生物生长产生毒害作用，限制微生物生长，胞外吸附和胞内吸附都会被抑制，降低去除率。KIRILLOVA等^[26]发现：在Cd²⁺初始质量浓度为5 mg/L时，已经对乳酸菌生长有所抑制，达到10 mg/L时，细菌几乎不生长。从图5也可以看到，Cd质量浓度过高重金属去除率下降的趋势。

2.2.4　温度对重金属去除率的影响　

在不同温度条件下菌株VCR02对重金属的去除效果如图6所示，从图6可见：Cd的去除效果几乎不受温度的影响。有研究者发现，微生物吸附水体中的Cd²⁺无论是活细胞或是死细胞都有吸附效果^{[20, 23]}，因此，在较高温度下，虽然微生物生长代谢受限，对Cd的去除效果影响不大。相反地，温度对钒的去除影响较为明显，这也证明了的去除需要先进行还原，而温度影响细菌的还原过程，从而温度过高或过低对去除效果均有负面影响。在30℃的条件下，2种重金属去除率均达最高点，Cd去除率达44.15%，V去除率达34.15%。

图6　温度对重金属去除率的影响

Fig. 6　Effects of temperature on removal rate of heavy metals

2.2.5　pH对重金属去除率的影响　

pH对重金属去除率的影响如图7所示。从图7可见：2种重金属去除率为拮抗趋势，pH为7时，镉去除率最高达到44.15%，此时，V去除率最低。

Cd去除率随pH增加呈先上升再下降的趋势，该趋势与多位研究者研究阳离子重金属吸附所得到的结果^{[23, 27-28]}相同。这是因为在低pH下，生物吸附剂表面的基团质子化，H⁺与Cd²⁺竞争结合位点^[26]；在高pH下，去除率降低可能与Cd的形态有关，如不易形成Cd(OH)₂使其得以去除^[23]。此外，在pH较高时，肉眼能够观察到培养基的浊度降低，即生物量减少，微生物生长受到一定影响。燕传明等^{[20, 23]}发现：从镉污染土壤中分离出的菌株Bacillus cereus RC-1的镉积累主要依赖于胞外吸附，故细菌数量减少会降低镉积累。

图7　pH对重金属去除率的影响

Fig. 7　Effects of pH on removal rate of heavy metals

当pH为6时，V的去除率最高，达到63.33%，此时，依靠静电吸引起到吸附效果；pH为7时，V的去除率最低，仅有34.15%，而随着碱度上升，V的去除率再次升高，pH为9时，达到59.05%，虽然使质子化现象减弱，但细菌在生长过程中能够把还原VO²⁺，培养基中的VO²⁺被带负电的细菌吸附并离心，达到良好的去除效果。

培养24 h后，V和Cd均能达到较高去除水平的最佳实验条件为：钒初始质量浓度200 mg/L、镉初始质量浓度5 mg/L、温度30 ℃。而pH对2种重金属去除率影响最大，拮抗趋势明显，在其他均为最佳条件下，pH为6时，V去除率达38.23%，pH为7时，Cd去除率达44.15%。

2.3　菌体的红外吸收光谱分析

利用细胞壁及EPS对重金属离子进行吸附是不依赖细胞代谢的过程，通过傅里叶转换红外光谱(FT-IR)能够检测出与重金属离子结合的基团^[29]。在菌株VCR02生长的培养基中加入重金属Cd²⁺和前后的FT-IR红外光谱如图8所示。从图8可见，菌体与分泌的胞外多聚物所带有的基团特征最适合的区域分布在1 000~1 700 cm^-1之间。在加入重金属前，主要特征峰在1 081.43，1 244.88，1 402.54，1 554.41，1 650.36，2 962.73和3 417.39 cm^-1处，表明菌株VCR02表面存在大量的磷酸二酯基团、酰胺基团(碳氮键、羰基)等；加入重金属后，菌体表面的基团没有发生变化，但是这些基团所对应的波谱有所偏移，特征峰值变为1 080.95，1 243.91，1 402.05， 1 552.00， 1 652.77， 2 961.77和3 414.49 cm^-1，说明这些基团与重金属的去除有关。

图8　菌株VCR02培养加入重金属前后红外光谱图

Fig. 8　Intra-IR spectra of bacterial strain VCR02 before and after adding heavy metals

细菌的细胞壁表面具有多种有机官能团如羟基、羧基、巯基、磷酸基团等，它们在与重金属结合效率很高^[8]。另一方面，微生物在生长过程中还会分泌大量胞外聚合物，其中包括多糖、蛋白质等^[30]，它们同样包含许多阴离子的官能团，能够与水中的重金属离子发生螯合作用使之去除。通过这2种方式，微生物能够阻止重金属进入细胞，从而减轻毒害作用^[31]。

在重金属吸附前后，菌株所对应的特征峰并没有出现消失以及新增的现象，说明在吸附过程中，重金属原子并没有使键发生破坏。在加入重金属后，氨基(—NH₂)所对应的吸收峰3 417.39 cm^-1偏移最大，下降至3 414.49 cm^-1。这表明在吸附过程中，氨基起到最为重要的作用，能够吸附重金属V和Cd。同时，磷酸二酯基团(PO^2-)、酰胺基团(C—N，C—H，C=O)、烷基(C—H)所对应的吸收峰分别由1 244.88，1 554.41，1 650.36和2 962.73 cm^-1偏移至1 243.91，1 552.00，1 652.77和2 961.77 cm^-1，表明这部分基团在生物吸附过程中发挥了作用，其中酰胺基团偏移较多，故在吸附过程中表现更活跃。

一般认为，含氧基团中的氧原子由于外层电子层不饱和，易于从其他原子中夺取电子，从而使得氧带负电荷，而带正电的Cd²⁺则会与氧负离子结合，形成普通的化学键甚至形成稳定的配位结构，从而实现对Cd²⁺的吸附。此外，能够观察到表中所示的含氮基团(酰胺基团、氨基)的吸收峰均有所变化，这可能是基团中的氮原子与重金属离子发生配位作用而产生的^[15]。燕传明等^[20]分别对活菌吸附、死菌吸附的菌体进行了FTIR分析，发现磷酸基团只在死菌中参与对重金属铅镉的吸附，所以在对菌株VCR02进行检测后，磷酸基团的吸收峰有所偏移，但偏移却不大。

3  结论

1) 4株菌均为革兰氏阴性，甲基红试验、葡萄糖产酸试验、蔗糖产酸试验中菌株VCR01，VCR02，VCR04呈阳性，菌株VCR03呈阴性，4株菌均不能水解淀粉，也不具有高盐度耐受性。菌株VCR01和VCR02对V去除效果较好，菌株VCR02和VCR04对镉去除效果较好，2种重金属总去除率从大到小顺序为：VCR02，VCR04，VCR01，VCR03。

2) 对钒镉去除效果最优菌株为VCR02，经16S rRNA测序鉴定为芽孢杆菌；因吸附位点的原因，钒镉2种重金属的去除效果多数呈拮抗趋势，但在最优实验条件下此趋势并不明显，V和Cd均能达到较高去除水平的最佳实验条件为：钒初始质量浓度200 mg/L、镉初始质量浓度5 mg/L、温度30 ℃；而在不同pH下，菌株表面基团质子化程度不同，直接影响V去除效果，pH为6时，V去除率最高达38.23%，pH为7时，Cd去除率最高达44.15%。

3) 加入重金属未使菌体表面基团发生改变，在重金属去除过程中，含氮基团氨基(—NH₂)起到最重要作用的基团，能与重金属离子发生配位反应；磷酸二酯基团(PO^2-)、酰胺基团(C—N，C—H，C=O)等基团也因静电吸附起到一定作用。

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(编辑  赵俊)

收稿日期： 2020 -07 -13; 修回日期： 2020 -08 -18

基金项目(Foundation item)：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2015ZX07205-003) (Project(2015ZX07205-003) supported by the National Science and Technology Major Program of Water Pollution Control and Treatment)

通信作者：林海，博士，教授，从事工业污水污染控制与回用、重金属污染防治与生态修复、环境微生物菌种开发与应用、环境功能材料开发与应用研究；E-mail:linhai@ces.ustb.edu.cn

引用格式： 林海, 李真, 董颖博, 等. 修复钒镉复合污染水体的菌株分离及性能[J]. 中南大学学报(自然科学版), 2021, 52(5):1418-1426.

Citation: LIN Hai, LI Zhen, DONG Yingbo, et al. Isolation and characterization of bacteria for vanadium and cadmium polluted water remediation[J]. Journal of Central South University(Science and Technology), 2021, 52(5): 1418-1426.