低基质浓度厌氧氨氧化颗粒污泥反应器的快速启动
唐晓雪，彭永臻，徐竹兵，杨雄
(北京工业大学 北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京，100124)
摘要：超过100 d的反应器启动时间制约了厌氧氨氧化工艺在城市污水处理工程中的应用。通过高上升流速的培养方式，在低基质反应质量浓度条件下(氨氮与亚硝态氮质量浓度分别为20 mg/L与26 mg/L)，启动厌氧氨氧化升流式厌氧污泥床(UASB)反应器。试验中，厌氧氨氧化反应器的启动时间为60 d，系统稳定运行期，平均总氮去除负荷(以N计)达到4.3 kg·m-3·d-1，氨氮与亚硝态氮的平均去除率分别达到99.3%与98.8%。在启动过程中，红褐色颗粒污泥快速形成，当系统运行至100 d时，反应器内79.3%的污泥粒径处于0.5~0.9 mm之间。通过定量PCR，对厌氧氨氧化菌在UASB反应器中的富集情况进行考察，发现厌氧氨氧化菌在反应器中为非均匀分布，反应器底部厌氧氨氧化细菌浓度较高，厌氧化细菌的基因拷贝数达到1.28×1011 个/gMLVSS。
关键词：厌氧氨氧化；快速启动；颗粒污泥；低基质质量浓度
中图分类号： X703 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2014)12-4445-07
Fast start-up of anaerobic ammonium oxidation (ANAMMOX) granular reactor treating low-strength wastewater
TANG Xiaoxue, PENG Yongzhen, XU Zhubing, YANG Xiong
(Beijing Key Laboratory of Water Quality Science and Water Environment Recovery,
Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)
Abstract: The start-up period of anaerobic ammonium oxidation (ANAMMOX) reactor usually took more than 100 d which restrained the application of ANAMMOX process in domestic wastewater treatment. The fast start-up of anaerobic ammonium oxidation(ANAMMOX) granular reactor was investigated under high up-flow velocity (5 m/h) when the ammonium and nitrite mass concentrations of the influent were 20 mg/L and 26 mg/L, respectively. The results shows that the nitrogen removal rate of ANAMMOX reactor reaches 4.08 kg·m-3·d-1 on 60 d which indicates the successful start-up of ANAMMOX reactor. During the stable operation period, the average nitrogen removal rate reaches 4.3 kg·m-3·d-1and the average ammonium and nitrite removal efficiencies reach 99.3% and 98.8%, respectively. The granules obtained from ANAMMOX reactor are rufous in color and the majority (79.3%) diameter of granules is in the range of 0.5-0.9 mm on 100 d. The abundance of ANAMMOX in up-flow Anaerobic sludge bed (UASB) reactor was also investigated by q-PCR. The results show that the concentration of ANAMMOX bacteria is much higher in the bottom of UASB reactor which reaches 1.28×1011 copy numbers·gMLVSS-1.
Key words：anaerobic ammonia oxidation (ANAMMOX); fast start-up; granular sludge; low strength wastewater
城市污水处理中普遍应用的传统生物脱氮工艺是在好氧条件下利用硝化细菌将氨氮氧化为硝态氮，而后在缺氧条件下利用反硝化细菌将硝态氮还原为氮 气[1-2]。该工艺在好氧曝气环节消耗了大量的能量，属于高能耗的污水处理工艺，污水处理费用较高。由于城市污水一般碳氮比较低，难以满足反硝化过程所需碳源，需投加甲醇等外碳源提高系统总氮(TN)去除率，外碳源的投加则进一步提高了脱氮系统的运行费用[3]。厌氧氨氧化细菌的发现给污水处理工艺的发展带来了新的契机，使低能耗、可持续的污水处理技术成为可能。厌氧氨氧化菌利用亚硝态氮酸盐替代氧，作为电子受体将氨氮转化为氮气，无需有机碳源，与传统生物脱氮工艺相比，可节约60%的曝气量及100%的有机碳源消耗[4-5]。城市污水属于低氨氮废水，具有水量巨大、污染物质量浓度低、水质随季节变化大等特点。颗粒污泥反应器由于生物体间结构紧凑，污泥的沉降性较好，可持留大量的厌氧氨氧化菌，并具有较高的总氮容积转化速率，这使得厌氧氨氧化工艺处理低基质浓度废水成为可能[6-7]。但厌氧氨氧化菌增殖缓慢(倍增时间为11 d)，细胞产率低，体积小，易流失，对环境条件敏感，厌氧氨氧化反应器的启动时间一般长达200~300 d。孟凡能等[8]采用UASB 反应器,接种由好氧颗粒污泥、厌氧颗粒污泥、氧化沟活性污泥及短程硝化活性污泥组成的混合污泥,以污泥脱水液经短程硝化处理后水质为进水，经过186 d 的运行启动厌氧氨氧化反应器。唐崇俭等[9]以硝化反硝化污泥、短程硝化污泥、厌氧絮体污泥和厌氧颗粒污泥混合接种，经过255 d的运行启动中试规模的厌氧氨氧化反应器。超过100 d的反应器启动时间直接制约了厌氧氨氧化工艺在城市污水处理工程中的应用[10-11]。因此，如何在低基质条件下快速培养出厌氧氨氧化颗粒污泥是亟待解决的问题。本试验采用升流式厌氧污泥床反应器，通过高上升流速(5 m/h)的培养方式，在低基质质量浓度条件下(氨氮与亚硝态氮质量浓度分别为20 mg/L与26 mg/L)，实现高效厌氧氨氧化颗粒污泥反应器的快速启动，并对厌氧氨氧化菌的数量和活性，颗粒污泥的形成过程进行分析，提出厌氧氨氧化反应器的快速启动策略，以期为厌氧氨氧化工艺在城市污水处理中的应用提供技术依据。
1 材料和方法
1.1 试验装置
本试验在上流式厌氧污泥床(UASB)反应器中进行，反应器由有机玻璃制成，有效容积为2 L，高径比20:1，如图1所示。反应器内径为5 cm，在器壁垂直方向上设有一排取样口。反应器表面用黑布包裹，避免反应器内藻类增殖及光对厌氧氨氧化菌的负面影响。废水由蠕动泵泵入反应器底部，由下而上流过反应器，经气固液三相分离器排出反应系统。反应器外包裹加热带并配有温控装置。试验期间，反应器内温度恒定为(28±1) ℃。
图1 试验装置
Fig. 1 Schematic diagram of experimental equipment
1.2 试验用水水质
试验采用模拟废水，NH4+-N质量浓度为(20±3.7) mg/L，NO2--N为(26±3.2) mg/L，KHCO3为110 mg/L，KH2PO4为2 mg/L，CaCl2·2H2O为20 mg/L，MgSO4·7H2O为20 mg/L，微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ各 0.4 mL/L。微量元素浓缩液Ⅰ组分为：EDTA质量浓度为5 mg/L，FeSO4为5 000 mg/L；微量元素浓缩液Ⅱ组分为：EDTA质量浓度为5×103 mg/L，ZnSO4·7H2O为430 mg/L，CoCl2·6H2O为240 mg/L，MnCl2·4H2O为990 mg/L，CuSO4·5H2O为250 mg/L，NaMoO4·2H2O为220 mg/L，NiCl2·6H2O为190 mg/L，NaSeO4·10H2O为210 mg/L，H3BO4 14为mg/L。
1.3 接种污泥
试验接种污泥分别取自3台反应器，其中20%种泥(% MLSS)取自本实验室硝化反硝化反应器，70%种泥取自厌氧硝化反应器，少量的厌氧氨氧化颗粒污泥经粉碎后加入混合污泥中。种泥初始污泥质量浓度为8.5 g/L，平均粒径小于0.2 mm。
1.4 分析项目与方法
水样经过0.45 μm 滤纸过滤后测定以下各参数：NH4+-N，NO2--N与NO3--N采用LACHAT-8500型流动注射仪测定；MLSS与MLVSS采用质量法测定；pH与溶解氧(DO)质量浓度采用WTW pH/Oxi 340i 测定。采用湿式筛分析法对颗粒污泥的粒径进行分析[12]。颗粒污泥采用奥林巴斯BX- 51及OLYMPUS C24040 ZOOM 数码像机进行微生物相观察。
采用DNA 试剂盒( FastDNA Spin Kit for Soil) 提取颗粒污泥中的DNA，厌氧氨氧化菌在颗粒污泥中的丰度通过实时定量PCR 进行测定，采用ABI7300 实时定量PCR 扩增仪(Applied Biosystems, CA, USA)，测定方法为SYBYGreen 法，每个样品测定3次。将Amx368f/Amx820r特异性引物作为扩增引物，扩增程序为：于95 ℃预变性3 min，于95 ℃变性0.5 min，于56 ℃复性0.5 min，于72 ℃延伸0.5 min，40个循环。扩增体系25 μL，配置如下： SYBR Premix Ex Taq (宝生物工程公司，Takara, 大连) 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 (1~10 ng)2 μL，9.5 μL灭菌水。通过NanodropsND-1000 UV-Vis 分光光度计 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)检测样品DNA质粒浓度，测定结果以每g MLVSS中厌氧氨氧化细菌的基因拷贝数量表示。
2 结果与讨论
2.1 厌氧氨氧化颗粒污泥反应器的快速启动
厌氧氨氧化反应器的快速启动过程可分为3个阶段(图2)。
阶段Ⅰ为适应期(1~15 d) ，在此阶段种泥中厌氧氨氧化细菌的活性得到了稳定和一定程度提高。由于好氧细菌的存在，消耗了进水中的溶解氧，为厌氧氨氧化菌创造了良好的生存环境，系统启动第1天，总氮去除负荷(以N计)即达到0.15 kg·m-3·d-1。逐步将进水量由10 L/d提升至30 L/d，至反应器运行第15天，系统总氮去除负荷(以N计)达到0.50 kg·m-3·d-1。适应期反应器内上升流速低于0.625 m/h，污泥堆积于反应器的中部以下。
阶段Ⅱ为负荷提升期(16~60 d)，在此阶段絮状污泥发生颗粒化并形成颗粒污泥。为促进泥水充分混合，增强传质，通过调节回流量将反应器内上升流速固定为5 m/h。反应器水力停留时间 (HRT) 由1.2 h逐步降至0.2 h，进水量每6 d提升1次，每次提高40 L，至第46天进水量达到240 L/d，而系统的回流量相应降低，由第16天的200 L/d降至第46天的0 L/d。每次提升负荷后，出水总氮质量浓度明显升高，但随后迅速降低，系统的总氮去除能力在此阶段提升了8倍。如图2所示，系统总氮容积负荷 (NLR) 由0.88 kg·m-3·d-1提升至5.25 kg·m-3·d-1，相应的总氮去除负荷快速提高，至第60天达到4.08 kg·m-3·d-1。较高的总氮去除负荷表明厌氧氨氧化反应器已实现快速启动。
阶段Ⅲ为稳定运行期 (61~100 d)，在进水负荷小幅波动的情况下，系统运行稳定高效，总氮平均去除负荷达到4.3 kg·N·m-3·d-1。系统出水平均总氮质量浓度为8.5 mg/L，其中氨氮、亚硝态氮与硝态氮的平均质量浓度分别为0.12，0.30与8.05 mg/L。
图2 厌氧氨氧化反应器的快速启动
Fig. 2 Fast start-up of ANAMMOX reactor
厌氧氨氧化细菌为自养菌，可固定污水中的CO2作为其生长所需的无机碳源，使系统出水pH升高。图3所示为系统启动过程中，pH与厌氧氨氧化反应化学计量关系变化情况。由图3可见：在启动初期 (1~10 d) 系统进水pH高于出水的pH，且该阶段平均亚硝态氮去除量/氨氮去除量(△ρ(NO2--N)/△ρ(NH4+-N)=1.40)，高于文献报道的理论值1.31，而硝态氮产生量/氨氮去除量(△ρ(NO3--N)/△ρ(NH4+-N)=0.20)，低于文献报道的理论值0.26。出水pH降低与系统中存在好氧硝化细菌及启动初期部分污泥的水解酸化作用直接相关，而硝态氮产生量较低则与反硝化细菌利用污泥水解酸化作用产生的碳源进行反硝化相关。伴随着水力停留时间的降低，系统进水量由30 L/d提升至240 L/d。由于进水未进行任何脱氧处理，随着进水量的快速提升，进水中的溶解氧(进水中溶解氧质量浓度为4~6 mg/L)使一部分硝化细菌得以增殖，系统的亚硝态氮去除量/氨氮去除量(△ρ(NO2--N)/△ρ(NH4+-N))不断降低，而硝态氮产生量/氨氮去除量(△ρ(NO3--N)/△ρ(NH4+-N))不断升高。
图3 启动过程中pH值与脱氮反应化学计量关系变化
Fig. 3 pH profile and stoichimetry of nitrogen removal process during start-up period
稳定运行期，系统对氨氮与亚硝态氮的平均去除率分别为99.3%与98.8%，明显高于其他文献报道值[13-14]。厌氧氨氧化反应的化学计量学关系如下，系统平均亚硝态氮去除量/氨氮去除量(△ρ(NO2--N)/△ρ(NH4+-N)=1.34)与文献报道的理论值1.31比较相近，但硝态氮产生量/氨氮去除量 (△ρ(NO3--N)/△ρ(NH4+-N)=0.43)，略高于理论值[15]。较高的氨氮去除率、亚硝态氮去除率及硝氮产生量，可能与反应器内硝化细菌的存在及进水中较高的溶解氧质量浓度(4~6 mg/L)直接相关。Li等[16]的研究结果表明：pH的变化可指示反应器中厌氧氨氧化细菌的活性变化趋势。稳定期系统出水pH明显高于进水的pH，从另一个角度说明，系统厌氧氨氧化细菌活性较高。
2.2 高上升流速条件下厌氧氨氧化颗粒污泥的快速形成
高上升流速(5 m/h)使反应器内污泥处于流化状态，又由于水力停留时间的逐步缩短，质量相对较低的活性污泥被冲出反应器，密度相对较大的活性污泥积累在反应器底部，逐渐形成了颗粒污泥。如图4所示，通过对反应器启动20 d，60 d和100 d时的污泥形态变化，直观地揭示颗粒污泥的形成过程。采用湿式筛分析法对颗粒污泥的粒径进行分析，其粒径分布如表1所示。反应器启动20 d后，系统内活性污泥主要为黄色的絮状污泥，结构较为松散，68.7%的污泥粒径小于0.2 mm；系统启动60 d后，反应器内颗粒污泥的凝结核形成，可见少量红色颗粒，污泥粒径明显增大，36.2%的污泥粒径增长至0.2~0.5 mm之间，系统启动100 d后，颗粒污泥结构密实，79.3%的污泥粒径增长至0.5~0.9 mm之间，反应器内污泥呈现厌氧氨氧化细菌典型的红褐色。
由此说明，以低基质浓度废水作为厌氧氨氧化UASB反应器进水，通过高上升流速加大水力剪切力，同时逐步提高系统水力停留时间实现对沉降性较差活性污泥的淘洗，可在较短时间内形成高效自养脱氮颗粒污泥。
表1 厌氧氨氧化反应器启动过程中污泥粒径分布比例
Table 1 Granule size distribution in ANAMMOX UASB reactor during start-up period
2.3 厌氧氨氧化细菌的高效富集
为考察反应器内厌氧氨氧化菌的富集情况，试验进行至100 d，在反应器顶部(85 cm)、中部(50 cm) 和 底部(20 cm) 3个部位取泥，通过实时定量PCR对反应器不同部位厌氧氨氧化菌的丰度进行测定，试验结果如表2所示。由表2可知：反应器底部厌氧氨氧化细菌浓度较高，厌氧化细菌的基因拷贝数达到1.28×1011 个/gMLVSS，而反应器顶部与中部污泥中厌氧氨氧化细菌含量分别为4.90×1010 个/gMLVSS与5.80×1010 个/gMLVSS。由于反应器底部污泥浓度高达28.7个/gMLVSS，为顶部污泥浓度的4.9倍。通过计算可以得出底部厌氧氨氧化细菌的总浓度为顶部的12.8倍。中部与顶部厌氧氨氧化细菌数量较少的原因主要受到该部位氮负荷较低的影响。
反应器内持留的高浓度厌氧氨氧化细菌是低基质条件下反应器运行高效稳定的主要原因。但厌氧氨氧化细菌在UASB反应器中为非均匀分布，主要分布在反应器的下部，反应器中部与上部厌氧氨氧化细菌含量相对较少，这表明反应器的处理负荷有较高的提升空间。由于该系统已成功培养出沉降性能良好的厌氧氨氧化颗粒污泥，可进一步缩短水力停留时间，提高进水负荷，从而实现反应器中部与顶部厌氧氨氧化细菌的富集。
图4 厌氧氨氧化颗粒污泥的形成
Fig. 4 Granular formation process of ANAMMOX reactor
表2 UASB 反应器中厌氧氨氧化菌的分布情况
Table 2 Abundance of ANAMMOX in UASB reactor
2.4 厌氧氨氧化反应器快速启动方法分析
由于生活污水氨氮质量浓度较低，仅为40~80 mg/L，维持较高的总氮去除负荷意味着反应器必须控制较低的水力停留时间，反应器内污泥具有良好的持留能力。目前，人们在膜生物反应器(MBR)，连续搅拌反应器(CSTR)与序批式反应器(SBR)等多种类型的反应器中实现了厌氧氨氧化的启动与稳定运行[17-19]。与其他类型的厌氧氨氧化反应器相比，生物膜反应器与颗粒污泥反应器的总氮去除负荷较高[20-21]。这是因为生物膜反应器内厌氧氨氧化细菌附着在填料上生长，而颗粒污泥反应器内厌氧氨氧化细菌形成颗粒污泥，均有效地减少了厌氧氨氧化细菌在反应器中的流失。另外，王俊敏等[6]的研究成果表明：与生物膜反应器相比，颗粒污泥反应器的泥水混合状态更好，颗粒污泥具有更大的比表面积，因此，颗粒污泥反应器的脱氮效率更高，且反应器不易堵塞无需反冲洗。
颗粒污泥是微生物凝聚的结果，在特定的水力条件下(水力剪切力，水力停留时间和沉降时间)，微生物细胞会相互聚集成为颗粒污泥。与生物膜反应器不同，颗粒污泥反应器的启动无需挂膜，但培养具有良好沉降性能的厌氧氨氧化颗粒，降低微生物的损失对反应器的稳定高效运行是至关重要的。试验中采用低基质浓度废水启动厌氧氨氧化UASB反应器，进水中的总氮质量浓度与生活污水较为相近，由于未对进水进行脱氧处理，该启动方式对以城市污水为基质的厌氧氨氧化反应器的启动更具指导意义。试验中厌氧氨氧化颗粒污泥反应器启动时间较短仅为60 d，反应器的快速启动与接种种泥性质，进水基质及反应器的运行方式直接相关。首先，进水中氨氮与亚硝态氮质量浓度低于对厌氧氨氧化菌活性的抑制质量浓度，有利于厌氧氨氧化细菌的快速富集。其次，已有研究成果表明厌氧氨氧化细菌活性的维持需要使其在溶液中的细胞浓度＞1010~1011 个/mL。因此，反应器启动过程中，处理负荷的初级提升是限速步骤。试验中通过接种少量的厌氧氨氧化污泥，使启动初期系统存在厌氧氨氧化处理效果，直接缩短了反应器的启动时间。最后，本试验在低基质浓度条件下，通过逐步降低水力停留时间提高反应器的总氮容积负荷，促进了厌氧氨氧化细菌的生长。同时随着水力停留时间的降低，污泥在反应器内的沉淀时间不断缩短，尺寸较大且密实的污泥因沉速较快而留在反应器中。高上升流速的恒定维持，使留存在反应器内的污泥在水力剪切作用下逐渐变规则，菌体间距逐步缩小，结构紧凑，最终形成红褐色的厌氧氨氧化颗粒污泥。
3 结论
1) 通过接种少量厌氧氨氧化颗粒污泥，在低基质浓度高上升流速的培养条件下，反应器启动60 d后，总氮去除负荷达到4.08 kg·m-3·d-1，实现了厌氧氨氧化反应器的快速启动。
2) 高上升流速为厌氧氨氧化颗粒污泥的形成创造了有利的条件，系统启动100 d后，79.3%的污泥粒径增长至0.5~0.9 mm之间，颗粒污泥结构密实，反应器内颗粒污泥呈现厌氧氨氧化细菌典型的红褐色。
3) 反应器内持留的高浓度厌氧氨氧化细菌是低基质条件下反应器运行高效稳定的主要原因。反应器底部厌氧氨氧化细菌浓度较高，厌氧化细菌的基因拷贝数达到1.28×1011 个/gMLVSS。由于该系统已成功培养出沉降性能良好的厌氧氨氧化颗粒污泥，可通过进一步缩短水力停留时间，提高进水负荷，从而实现反应器中部与顶部厌氧氨氧化细菌的富集。
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(编辑 邓履翔)
收稿日期：2013-12-14；修回日期：2014-02-25
基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金资助项目(21177005)；北京工业大学研究生科技基金资助项目(ykj-2012-8308)(Project (21177005) supported by the National Natural Science Foundation of China; Project (ykj-2012-8308) supported by the Graduate Students Technology Foundation of Beijing University of Technology, China)
通信作者：彭永臻(1949-)，男，黑龙江哈尔滨人，博士，教授，从事污水处理与过程控制、脱氮除磷等研究；电话：010-67392627；E-mail：pyz@bjut.edu.cn
