三国吴简蚀斑可培养微生物的多样性
柴立元，陈跃辉，黄燕，杨志辉
(中南大学 冶金科学与工程学院，湖南 长沙，410083)
摘 要：采用普通细菌和真菌培养基，从湖南长沙简牍博物馆收藏的一批走马楼出土的三国时期吴国竹简腐蚀浸泡液中分离得到8株细菌和1株霉菌的纯培养。结合培养特征、形态特征、基于细菌16SrDNA和真菌18SrDNA和ITS基因序列的系统发育分析，对分离得到的可培养微生物的多样性进行研究。研究结果表明：8株细菌分别划归为4个纲(α-Proteobacteria，β-Proteobacteria，γ-Proteobacteria和Bacilli)的7个属(Bacillus，Acinetobacter，Staphylococcus，Pandoraea，Novosphingobium，Cupriavidus和Comamonas)；霉菌属于Aspergillus。
关键词：
三国吴简；竹简蚀斑病；微生物多样性；16SrDNA；18SrDNA和ITS；系统发育分析；
中图分类号：Q93.3 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2010)05-1674-06
Diversity of culturable microorganisms from erosive bamboo slips of Kingdom Wu
CHAI Li-yuan, CHEN Yue-hui, HUANG Yan, YANG Zhi-hui
(School of Metallurgical Science and Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)
Abstract: 8 bacterial strains and 1 fungus strain were isolated from steeping fluid of the erosive bamboo slips using bacterial and fungal medium, and the bamboo slips were derived from Kingdom Wu during the Three-Kingdoms period and were stored in Bamboo Slips Museum of Changsha, Hunan Province, China, which were eroded severely by microorganisms in the storing period. Based on the cultural, morphological characteristics of the strains, and sequence analysis of the nucleic acids (parts sequence of 16SrDNA of the bacterial strains and 18SrDNA and ITS of the fungi strain), the bacteria belong to seven genera (Bacillus, Acinetobacter, Staphylococcus, Pandoraea, Novosphingobium, Cupriavidus and Comamonas) of four different classes (Bacilli, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria), and the fungus strain shows great similarity to Aspergillus.
Key words：bamboo slips of Kingdom Wu; erosive microorganisms; microorganism diversity; 16SrDNA; 18SrDNA and ITS; phylogenetic analysis
竹简是中国在晋以前档案的主要载体，对我国传统文明的传播起了至关重要的作用。湖南长沙简牍博物馆收藏了一批走马楼出土的三国时期吴国竹简，具有极为珍贵的史料价值。在出土后保存过程中，该批竹简爆发了一种竹简蚀斑病，竹简损害严重，白斑中的竹简竹体变为半透明膜状物质。胡东波等[1]从走马楼出土的带菌竹简浸泡液中分离出未知的M菌、桔青霉、黄曲霉、黑曲霉等霉菌和副球菌，通过对竹简被侵害的特征以及竹简蚀斑病爆发的环境条件进行分析，认为其中的霉菌M菌是造成竹简腐蚀斑的主要侵害菌；Zeng等[2] 采用牛肉膏蛋白胨培养基从该批爆发蚀斑病的竹简中分离出10株细菌，其中菌株Be-2反接回废竹片，能使竹片的表面由原来的亮褐色变成黑褐色，且在竹片上形成的腐蚀斑与初始爆发的腐蚀斑相似。然而，目前还缺乏证据证明导致该批竹简发生蚀斑病的微生物的种群和分类地位，病原菌还未得到分离，其快速侵蚀竹简的机制更是未知。本研究以该批爆发蚀斑病的竹简浸泡液为原料，采用适于各种微生物生长的不同丰富培养基分离纯化其中的微生物，并对获得的纯培养进行多样性分析，以期为进一步研究不同种群微生物在竹简腐蚀过程中的作用提供依据。
1 材料和方法
1.1 培养基
牛肉膏蛋白胨：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1 000 mL。
高氏一号：KNO3 1 g，可溶性淀粉20 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1 L。
查氏培养基：蔗糖 30 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO4 1 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1 L。
1.2 菌株分离与纯化
将长沙简牍博物馆密封保藏的竹简浸泡液分别接种于牛肉膏蛋白胨、高氏一号以及查氏培养基进行富集培养。培养物以稀释平板法结合划线分离法在相应的固体平板上进行分离，直至获得各种微生物的纯培养为止。培养温度为30 ℃。
1.3 菌株基因组DNA提取、PCR扩增和序列分析
1.3.1 细菌16SrDNA PCR
采用菌落PCR扩增所获得的细菌的部分16SrDNA片段，从固体平板上挑取单克隆，用solutionⅡ(10 μL 10% SDS，2 μL 40% NaOH，88 μL超纯水)裂解菌体，裂解液稀释后作为模板，引物为细菌16SrDNA通用引物(27F，1492R)[3]。
1.3.2 真菌18SrDNA和ITS PCR
真菌基因组DNA采用氯化苄法[4]提取，根据真菌18SrDNA保守区域设计引物。ITS(包括ITS1，5.8SrDNA，ITS2)序列用通用引物ITS4和ITS5[5]扩增，引物由上海生物工程有限公司合成。
18SrDNA引物序列为：
Pf: 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′；
Pr: 5′-CGACGGGCGGTGTGTAC-3′。
ITS 引物序列为：
ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
ITS5: 5′-GGAAGTAAAAGTAACAAGG-3′。
1.3.3 序列分析
PCR产物经琼脂糖DNA回收试剂盒(天根，北京)切胶回收后，由上海生物工程有限公司完成测序。将得到的细菌16SrDNA、真菌18SrDNA以及ITS序列与NCBI中的核酸数据库进行Blast比对，利用Mega 4.0软件分析亲缘关系、构建系统发育树。
1.3.4 细菌多样性分析
定义16SrDNA序列相似性小于97%作为不同的分类单元，采用Shannon Wienerps指数(以下简称Shannon多样性指数H)计算多样性[6]：
式中：s为物种(这里采用分类单元)数目；Pi为属于第i种的个体占全部个体的比例。
2 结果
2.1 菌株分离及形态特征
长沙简牍博物馆密封保藏的腐蚀竹简浸泡液经无菌操作接种于各种丰富培养基，富集培养、分离纯化后，共获得8株细菌以及1株霉菌的纯培养，分别命名为菌株B-1，B-2，B-3，B-4，B-6，B-7，B-8，B-9以及F-1。其菌落形态、革兰氏染色和菌体形态如表1所示。
2.2 细菌16SrDNA序列与多样性分析
2.2.1 16SrDNA序列分析
通过菌落PCR扩增得8株细菌的16SrDNA 1 500 bp左右片段，经测序获得相关序列，将这些序列与NCBI的核酸数据库进行Blast比对，结果如表2所示。所有分离得到的细菌16SrDNA序列均与数据库中已知细菌的相关序列有较高的相似性(≥99%)。定义16SrDNA序列相似性低于97%时作为不同分类单元进行多样性计算，结果表明分离得到的8株细菌可分为7个不同的分类单元，Shannon多样性指数为2.92。
2.2.2 细菌系统发育分析
基于分离细菌16SrDNA序列基础上的系统发育分析结果(图1)表明：这些细菌分别属于4个不同的纲，包括α-Proteobacteria(1株)，β-Proteobacteria(3株)，γ-Proteobacteria(1株)以及Bacilli(3株)。
结合菌落形态、细胞形态和基于分离细菌16SrDNA序列基础上的系统发育树分析，Bacilli纲的3株细菌中B-1和B-3属于Bacillus，B-4为Staphylococcus，Bacillus是分离得到的优势细菌；β-Proteobacteria纲
表1 各分离菌株形态学特征及革兰氏染色情况
Table 1 Morphological characteristic of the isolated strains
表2 分离细菌16SrDNA序列分析
Table 2 Analysis of partial 16SrDNA gene sequences of the isolated strains
的菌株B-6，B-8和B-9分别属于Pandoraea，Cupriavidus和Comamonas；α-Proteobacteria纲的菌株B-7属于Novosphingobium；γ-Proteobacteria纲的菌株B-2属于Acinetobacter。
2.3 真菌的分类鉴定
以氯化苄法提取霉菌F-1的基因组DNA，以此作为模板PCR扩增得到该菌的18SrDNA和ITS部分片段，经测序获得相关序列，将这些序列与NCBI的核酸数据库进行Blast比对，结果如表3所示。
从表3可知：霉菌F-1的18SrDNA和ITS 序列均与曲霉属(Aspergillus)有很高相似性(99%)。基于霉菌ITS序列的系统发育分析结果(图2)表明：霉菌F-1与Aspergillus的关系密切，由此将霉菌F-1归为曲霉属的1个种。
图1 基于分离细菌16SrDNA序列构建的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic analysis based on the 16SrDNA sequences of the isolated strains
表3 霉菌F-1 18SrDNA及ITS序列比对结果
Table 3 Analysis of partial 18SrDNA and ITS of the isolated fungus
图2 基于霉菌F-1 ITS序列构建的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS sequences of the strain F-1
3 讨论
.湖南长沙走马楼出土的竹简的竹材经鉴定为刚竹属，竹材主要成分为木质素、纤维素和半纤维素，另外还有少量的抽提物和灰分[7]。竹材的腐蚀是真菌、细菌共同作用的结果，吴开云等[8-10]分离了大量能引起竹材霉变的霉菌，而关于细菌在竹材腐蚀中的作用研究较少。傅筱冲等[11]在土法造纸嫩毛竹自然发酵过程中分离纯化得到了100株细菌，60株为芽孢杆菌，另外40株有微球菌、葡萄球菌、李氏杆菌、不动杆菌、肠杆菌等，并发现其中的3株芽孢杆菌能使嫩毛竹明显软化。李超等[12]从毛竹林地的腐朽竹伐桩分离筛选出16株具有较好纤维素或木质素降解能力的菌株，其中8株霉菌、5株细菌和3株放线菌。Zeng等[2]从走马楼出土的竹简中分离出属于4个属的10株细菌，但这些菌株降解竹材的能力未见报道。
本研究采用牛肉膏蛋白胨、高氏一号和查氏培养基3种培养基分离竹简浸泡液中的微生物，得到8株细菌及1株霉菌，属于Bacillus，Acinetobacter，Staphylococcus，Pandoraea，Novosphingobium，Cupriavidus，Comamonas以及Aspergillus，呈现出丰富的生物多样性。目前，已发现来自Bacillus，Acinetobacter以及Aspergillus中的一些菌株具有降解木质素的能力。Chandra等[13]从造纸废水中分离出3株具有较强木质素降解能力的Bacillus sp.，6 d即可使木质素降解30%~40%；Gajanan等[14]从一株Acinetobacter sp.中纯化得到了木质素过氧化物酶。曲霉菌(Aspergillus sp.)则是一种常见的木质素、纤维素降解菌。习兴梅等[15]从农林废物堆肥中分离得到一株黑曲霉，对木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别为16.87%、39.85%和45.32%。Ahammed等[16]从红树林中分离得到一株Aspergillus sp.，并测定了其木质素过氧化物酶活性。木质素、纤维素和半纤维素的结构单元中含有大量的芳香基和苯环结构，Staphylococcus，Pandoraea，Novosphingobium，Cupriavidus和Comamonas的细菌未见报道参与木质素降解，对芳烃类、苯酚类有机物的降解却有较多报道。卢涛等[17]分离得到一株能降解邻硝基酚细菌Staphylococcus sp.；蒋析文等[18]对一株Pandoraea sp.的氯苯降解机理进行了深入的研究；崔志松等[19]从厦门近海海水中筛选到一株能够降解多环芳烃的细菌Novosphingobium sp.；Sanchez等[20]对一株2, 4, 6-三氯苯酚降解菌Cupriavidus necator JMP134的遗传特性进行了研究。吴建峰等[21]从污水处理厂分离了一株能以对氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长的丛毛单胞菌(Comamonas sp.CNB1)。因此，从三国吴简中分离出的菌株具有降解木质素、纤维素和半纤维素的潜力，其降解木质素、纤维素和半纤维素的能力和相关机制有待进一步通过实验证明。
4 结论
(1) 采用细菌和真菌普通培养基，从腐蚀竹简浸泡液中共分离得到9株可培养菌株，其中有8株细菌，1株霉菌。
(2) 分析了从被腐蚀竹简中分离得到的9株菌具有降解木质素、纤维素和半纤维素的潜力。
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收稿日期：2009-10-24；修回日期：2010-01-24
基金项目：国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(2007AA021304)
通信作者：黄燕(1979-)，女，江苏常熟人，博士，讲师，从事环境微生物研究；电话：0731-88830875；E-mail: huangyan.hnu@gmail.com
