药对桂枝-白术及其单味药中挥发油成分GC-MS的

比较分析

佘金明^{1, 2}，钟明¹，梁逸曾¹，彭友林³，张茂美²，谭斌斌¹

 (1. 中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；

2. 常德职业技术学院 药学系，湖南 常德，415000；

3. 湖南文理学院 生命科学系，湖南 常德，415000)

摘  要：采用水蒸气蒸馏法从桂枝、白术及其药对中提取挥发油成分，通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对其进行分离检测，结合直观推导式演进特征投影法(HELP)对重叠色谱峰进行分辨解析；同时，利用程序升温保留指数辅助定性。研究结果表明：从单味药桂枝、白术及其药对中鉴定出66，29和55个组分，分别占挥发油成分总量的94.43%，95.93%和96.35%；单味药与药对共有4种组分，占药对挥发油总含量的13.14%；组成药对后，新增4种组分，单味药桂枝消失33种组分，白术消失7种组分；药对中挥发油主要成分是2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚、γ-芹子烯和桂皮醛等，它们主要来自于白术；药对种类与含量变化并不是单味药的简单相加，其作用机理有待进一步研究。

关键词：直观推导式演进特征投影法；药对；桂枝-白术；挥发油；气相色谱-质谱

中图分类号：O657          文献标志码：A         文章编号：1672-7207(2011)01-0022-06

Comparative analysis of volatile constituents in herbal pair Ramulus Cinnamomi-Atractylodes macrocephala and its signal herb by GC-MS

SHE Jin-ming^{1, 2}, ZHONG ming¹, LIANG Yi-zeng¹, PENG You-lin³, ZHANG Mao-mei², TAN Bin-bin¹

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;

2. Department of Pharmacy, Changde Vocational and Technical College, Changde 415000, China;

3. Science of Life Department, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Abstract: The volatile constituents were extracted from Ramulus Cinnamomi(RC), Atractylodes macrocephala(AM) and herbal pair(HP) RC-AM by steam distillation. Using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined with heuristic evolving latent projections(HELP), a useful chemometric resolution method which can be used to resolve overlapping peaks in chromatogram, was employed to identify and comparatively analyze the volatile constituents, together with the temperature-programmed retention index for assistant identification. The results show that there are 66, 29 and 55 kinds of constituents of the essential oils being identified respectively from single herb RC, AM and HP-RC-AM, and the relative amount accounts for 94.43%, 95.93% and 96.35 % of the total relative contents in order. There are 4 common volatile constitutions in single herb and HP, and accounting for 13.14% total contents in HP. There are 4 components increasing in HP, while there are 33 and 7 components losing in the single herb CR and AM respectively. The volatile principally components in HP are 2-(2-Methoxyphenoxy)phenol, γ-Selinene and Cinnamaldehyde, et al., and they are mainly from single herb AM. Their relative kinds and amount in HP are not equal to the two single herbs, whose reaction mechanism in HP should be studied further.

Key words: heuristic evolving latent projections; herbal pair; Ramulus Cinnamomi-Atractylodes macrocephala; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry

药对专指临床上相对固定的2味药所组成的方剂，是中药复方配伍中最简单、最基本和最常见的形式。它在临床上产生作用的大小直接受配伍规律的影响；因此，分析药对配伍前后发生的化学变化和物理作用，有利于剖析和阐明复方中药的配伍机理，促进药对的理论研究和临床应用^[1]。可见，加强药对的配伍规律研究是解决中药复方配伍理论这一核心问题的基础和重要切入点^[2]。桂枝Ramulus Cinnamomi(RC)为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl．的干燥嫩枝，主产于广东、广西、云南等地；白术系菊科植物白术atractylodes macrocephala koidz．(AM)的根茎，主要分布于浙江、江西、湖南、湖北等省^[3-4]。二者收载于《中华人民共和国药典》第1部。桂枝-白术都是辛温解表药，且为常用脾胃相辅药对。桂枝辛甘而温，走表则温经散寒，以驱表邪，入里则温阳散结，以暖脾胃；白术甘温苦燥，善于补脾气，燥化水湿，与脾喜燥恶湿之性相合，为补脾要药，除风痹之品。桂枝配白术，既可走表，温经通络，除痹止痛，又可走里，以温中健脾化湿^[5]。现代医学研究表明，桂枝、白术还具有抗肿瘤的特殊作用^{[4, 6]}。目前，桂枝和白术单味药中挥发油成分已有报道^[7-11]，它们是临床应用的主要活性成分来源，但该药对中挥发油成分未见报道。本文拟采用化学计量学中的直观推导式演进特征投影法(Heuristic evolving latent projections，HELP)^[12]，对桂枝-白术中GC-MS分析的色谱峰与单味药进行比较，得到药对与单味药挥发油成分的种类与含量变化，为建立它们的指纹图谱、研究药对的配伍规律及寻找新的活性成分提供依据。

1  理论基础

直观推导式演进特征投影法(HELP)由Kvalheim等^[13-14]提出，其基本原理如下。

由n种有机化合物响应信号组成的GC-MS二维数据矩阵A₀，可表示为：

               (1)

式中：C=[c₁, c₂, …, c_n]，矢量c_i是化合物i的纯色谱；S=[s₁, s₂, …, s_n]，矢量s_i是化合物i的纯质谱；T代表矩阵转置；A_b为背景矩阵；E为随机误差阵。设扣除背景后的矩阵为A，式(1)可写为：

                  (2)

对矩阵A进行主成分分解得：

                  (3)

式中：T为含n列的得分矩阵，称为抽象色谱矩阵；P为含n列的载荷矩阵，为抽象光谱矩阵；对n阶满秩方阵R，RR^-1=I，结合式(3)，有：

     (4)

比较式(2)和式(4)可得：

                    (5)

R称为旋转矩阵，具有将抽象色谱转换为真实色谱的功能。上式对应的矢量表达式为：

                   (6)

式(6)中r_i是矩阵R中第i列。在HELP中，对于不含有包埋色谱峰的重叠体系，利用选择性区域，零浓度区域可确定r_i，在此基础上化合物i的纯色谱c_i可由式(6)计算，其纯质谱s_i可以通过其选择性区域直接求出，结合s_i和c_i即可对化合物i进行准确的定性定量分析。

该方法充分利用了二维矩阵数据的色谱、光谱2个方面信息，采用局部主成分分析和满秩分辨技术得到混合物中各个组分的纯色谱和光谱，从而实现对色谱重叠峰组分进行定性定量分析，为复杂样品分析给出了一条新途径，已成功应用于中药现代化研究^[15-17]。

2  实验部分

2.1  仪器、药材与试剂

仪器为：GC-MS-6890-5973型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司生产)，标准玻璃挥发油提取器(上海满贤经贸有限公司生产)。

药材为：广东产桂枝、湖北产白术(长沙九芝堂药材公司)，樟科植物肉桂的干燥嫩枝和菊科植物白术干燥根茎的土炒品。

试剂为：无水硫酸钠和正己烷，均为分析纯；正构烷标准溶液C₈~C₂₀和C₂₁~C₄₀(美国Sigma公司生产)。

2.2  挥发油提取与供试液配制

2.2.1  药对挥发油提取

将桂枝、白术样品粉碎成粒径为250 μm粉状，分别取60 g和40 g(临床用药要求)药粉混合装入1 L的圆底烧瓶中，加水500 mL振摇混合后浸泡2 h，按《中国药典》(2005版)一部附录“挥发油提取法”甲法进行，连接挥发油测定器与回流冷凝管，然后，进行水蒸气蒸馏，并保持微沸约4 h，至测定器中油量不再增加时停止加热。按规定操作，用移液管或吸管取出挥发油，用无水硫酸钠干燥，测得其挥发油产率为0.85%。该挥发油为具有香味的黄色透明油状液体。

2.2.2  单味药挥发油的提取

分别称取上述粉碎过筛后的桂枝、白术各100 g，按上述方法提取，分别得到质量分数为0.53%的淡黄色特殊香郁油状物和1.15%的金黄色黏稠挥发油。

2.2.3  供试液配制

从药对药挥发油中取100 μL，用正己烷定容至3 mL，然后用针筒式微孔滤膜过滤，低温贮存，供进样用。再用同样的方法对单味药挥发油进行前处理。

2.3  GC-MS分析条件

色谱条件：采用程序升温，从50 ℃开始维持2 min，以12 ℃/min升温速度升至130 ℃，再以4 ℃/min升至240 ℃维持2 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃并维持2 min结束；HP-5MS弹性石英毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气为He气(99.999%)；载气流速为1.0 mL/min；进样口温度为280 ℃；分流比为50?1；进样量为1 μL。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)；离子源温度为230 ℃；接口温度为280 ℃；电子能量为70 eV。

3  结果与讨论

3.1  挥发油成分的定性分析

图1所示为上述实验条件下，桂枝、白术及其药对挥发油成分的GC-MS总离子流图(TIC)。通过质谱工作站检索，可以初步确定上述物质中各色谱峰的特征。以图1(a)中的峰簇P(保留时间段为13.632~ 13.790 min)为例，将其放大(见图2(a))，得到1个不规则的齿峰，在不同位置呈现出较大的质谱变化，从而可以进一步确定它是一组重叠峰。直接检索其定性结果与相似度从左至右依次为：γ-himachalene(91%)，γ-Muurolene(66%)，Copaene(89%)，α-Curcumene(83%)和(+)-cycloisosativeene(85%)。该结果表明它们的可信度较低，不利于进行定量分析。但是，通过HELP对重叠峰进行解析后，得到它们的纯色谱图(见图2(b))和质谱图。这是一个质谱特征明显、相似度很高的3组分，通过与NISI-05库检索，分别得到γ-Muurolene (98%)，α-Curcumene(94%)和α-Muurolene (97%)。

图1  桂枝、白术和药对桂枝-白术挥发油的总离子流图

Fig.1  TICs of essential oil from Ramulus Cinnamomi (RC)(a), atractylodes macrocephala (AM)(b) and herbal pair HP RC-AM(c)

用相同的方法对桂枝、白术和桂枝-白术的TIC图进行解析，并结合程序升温保留指数及相关资料，分别鉴定出66，29和55个组分，占系统自动检识峰数量的91.67%，87.9%和93.22%。

3.2  挥发油成分的定量分析

对解析后的所有纯色谱的峰面积进行积分，得到单味药与药对挥发油中各化学成分的定量分析结果，见表1。

图2  图1(a)中峰簇P的TIC图及应用HELP解析后的色谱图

Fig.2  TICs of P peak cluster in Fig.1(a) and resolved chromatograms of P peak cluster with HELP

表1  桂枝(RC)、白术(AM)和桂枝-白术(RC-AM)样品挥发油中主要化学成分分析结果

Table 1  Result of main chemical compositions analysis for essential oils from RC, AM and RC-AM samples

3.3  单味药与药对中挥发油成分比较

中药在合煎过程中存在水解、氧化-还原、脱羧、聚合与异构化反应等，且同时伴有助溶作用；因    此，药对中其种类与含量变化并不等于2种单味药的简单相加。如单味药桂枝组成药对后的变化，一是由于桂枝中含量低于0.50%的成分达32种，只占其挥发油的6.43%，它们在蒸馏过程中易被散失，组成药对后，消失了21种组分；二是发生化学变化，生成了新物质，如桂枝中的桂皮醛组成药对后其含量由23.78%下降至4.90%。另外，该药对中异构化现象比较明显，如药对中的主要成分γ-芹子烯，如果它是单味药加和，则它在药对中的含量应该是6.00%~7.00%，而实际是20.06%。从物质的结构和含量变化来看，一部分来自于白术中的芹子烯，另一部分可能是从存在于桂枝与白术中芹子烯的异构体转化而来。

由于药材产地与提取方法不同，导致药材主要挥发油成分的种类与含量也存在较大差异。单味药桂枝与白术不同种属，因此，它们的共有成分较少；桂枝中含量最高的是桂皮醛，与文献[7]中的结果一致，而文献[8]报道的挥发油主要成分是芳樟醇(14.85%)和二十七烷(10.96%)、顺式细辛醚(7.54%)等；白术中含量最高的是2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚，这与文献[9-10]中结果一样，而与文献[11]中报道的苍术酮含量不  一致。

4  结论

(1) 从桂枝、白术及其药对中鉴定出66，29和55个组分，分别占其挥发油总量的94.43%，95.93%和96.35%；单味药与药对共同含有4种挥发油成分，分别是丁子香烯、甘香烯、雅槛蓝树油烯和β-马阿里烯，占药对挥发油总量的13.14%，而它们在单味药中的对应量分别为3.69%和7.20%；组成药对后，单味药桂枝消失33种组分，白术消失7种组分。药对新增4种组分，其成分依次为3-利胆醇、2-丁酰基呋喃、橙花醇乙酸酯和醋酸金合欢醇酯。

(2) 桂枝中主要含有桂皮醛、cis-细辛醚、O-甲氧基桂皮醛、γ-杜松烯等；白术以2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚、γ-芹子烯等为主要成分；而药对中挥发油成分主要是2-(2-甲氧基)苯甲氧基苯酚、γ-芹子烯、大根香叶烯B、雅槛蓝树油烯、桂皮醛等，它们主要来自于单味药白术。

(3) 通过HELP解析重叠色谱峰后进行定性定量分析，将会极大地减少误检、漏检，从而提高分析的可靠性与准确度。该方法与GC-MS技术已成为研究药对中挥发油成分种类、含量变化及其机理的有力  工具。

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(编辑 张曾荣)

收稿日期：2009-12-30；修回日期：2010-04-06

基金项目：国家自然科学基金资助项目(20875104)

通信作者：梁逸曾(1950-)，男，湖南长沙人，教授，博士生导师，从事分析化学和中药化学研究；电话：0731-88830824；E-mail: yizeng_liang@263.net