DOI: 10.11817/j.issn.1672-7207.2015.12.045

利用PCR-DGGE分析茂名油页岩矿区土壤细菌群落组成

蒋绍妍¹，王文星²，薛向欣¹，徐坤²

(1. 东北大学 材料与冶金学院，辽宁 沈阳，110819；

2. 东北大学 生命科学与健康学院，辽宁 沈阳，110819)

摘要：为了了解油页岩矿区土壤环境中细菌群落的物种组成结构，以野外多点采集广东茂名油页岩矿区土壤样品作为研究对象，采用改进的SDS高盐提取法提取微生物总DNA，并利用PCR-DGGE技术分析细菌群落菌属种类。结果表明：DGGE指纹图谱中共包含13个操作分类单元(OTUs)，它们涉及变形菌门(α-，β-，γ-)、厚壁菌门和绿湾菌门3个细菌门类，其中，α-变形菌有3个OTUs，分别属于Altererythrobacter，Chelativorans和Sphingomonas菌属；β-变形菌有3个OTUs，它们属于Hydrogenophaga和Thiobacillus菌属；γ-变形菌有4个OTUs，它们属于Acinetobacter和Pseudomonas菌属；厚壁菌门有2个OTUs，分别属于Faecalibacterium和Bacillus菌属；绿湾菌门有暂时无法确定菌属的1个OTU。

关键词：油页岩矿；细菌多样性；PCR-DGGE；16S rDNA；茂名

中图分类号：Q938.1+3             文献标志码：A         文章编号：1672-7207(2015)12-4719-06

Composition of bacteria in soil from oil shale mine in Maoming using PCR-DGGE technique

JIANG Shaoyan¹, WANG Wenxing², XUE Xiangxin¹, XU Kun²

(1. School of Materials and Metallurgy, Northeastern University, Shenyang 110819, China;

2. College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Shenyang 110819, China)

Abstract: Improved SDS-high-salt extraction method was used to extract microbial total DNA from the soil of multi-point collection. PCR-DGGE was applied to analyze the community structure of bacteria in soil from oil shale mine in Maoming of Guangdong Province. The results show that a total of thirteen operational taxonomic units (OTUs) are isolated from the PCR-DGGE patterns. Proteobacteria (α-, β-, γ-), Firmicutes and Chloroflexi are the dominant bacterial communities in this habitat. Ten OTUs which belong to seven genera of Proteobacteria including Altererythrobacter, Chelativorans, Sphingomonas, Hydrogenophaga, Thiobacillus, Acinetobacter and Pseudomonas are identified. Two OTUs which belong to two genera of Firmicutes including Faecalibacterium and Bacillus are identified, and one OTU which belongs to unidentified genus of Chloroflexi is also identified.

Key words: oil shale mine; bacterial diversity; PCR-DGGE; 16S rDNA; Maoming

油页岩是一种高灰分含可燃有机质的沉积岩，属非常规油气资源，可作为燃料直接燃烧发热、发电，在建筑方面也具有一定的应用价值^[1]。我国油页岩地质储量约329.89亿t，主要分布在辽宁、吉林和广东等省。目前，油页岩的开发利用主要以物理化学法为主，该处理方式在获取页岩油的同时产生大量油页岩渣，将其丢弃堆置在矿区附近，会造成环境污染和耕地破坏等生态问题^[2]，而且生产成本高。微生物是重要的生物资源和基因资源。随着对环境微生物认识的不断加深，人们发现环境中存在的有机物几乎都可以找到使之降解的微生物。微生物浸溶采矿的研究始于1947年，Colmer等^[3]从矿山酸性矿水中分离鉴定出氧化亚铁硫杆菌，并证实了其在浸出矿石中的生物化学作用；吕人豪等^[4]从不同矿山酸性矿水中分离得到了氧化硫硫杆菌等嗜酸菌。将微生物浸矿技术应用于油页岩的研究虽然起步早^[5]，但发展较慢，相关报道较少^[6-7]，研究成果主要是利用生物催化作用浸提油页岩中的矿物组分^[8]，或利用生物表面活性剂驱提页岩油^[9]，为了加快微生物浸矿技术的应用，首先应对油页岩矿区环境中本源微生物进行深入了解。一般用于降解矿物的微生物都是先从矿区周围环境中分离出来，再进行遗传学上的改造，提高其环境耐受力和转化率。目前，仅有关于黑页岩、原油和天然沥青等沉积岩本源细菌的相关报道^[10-11]，对油页岩细菌群落的认知欠深入。自然栖息群中的微生物仅有0.01%~10%可以用现有技术培养，因而采用传统技术研究微生物资源有较大的局限性。随着分子生物技术的不断成熟和应用，人们已有可能绕过菌株分离培养这一步骤，而直接在基因水平上研究微生物群体的组成结构及其功能作用。DGGE(变性梯度凝胶电泳)是由Fischer等^[12]提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术， Muzyer等^[13]将其应用于微生物群落研究。在此，本文作者以广东茂名油页岩矿区土壤作为研究对象，利用PCR-DGGE分析其优势细菌菌属种类，以期为开发利用油页岩矿区这一特殊环境中丰富的生物基因资源提供参考。

1  材料与方法

1.1  采样方法和样品性质

选择广东茂名油页岩露天开采矿(21°41′N，110°58′E)作为采样地，该矿区为热带亚热带季风气候，夏季较长，冬季温暖，四季温差不大；年平均气温为22~23 ℃，年降水量为1 500~1 800 mm。该矿区油页岩挥发份为28.10%(质量分数，下同)，灰分为63.14%，烧失量为36.86%，水不溶物为96.60%。采集矿体表层土壤作为实验样品，采样日期为2012-07-10。在矿区内设置3个长×宽为20 m×20 m、间隔500~1 000 m的重复取样地，每个重复取样地内按十点取样法取样。取样时铲去表面土壤以防空气细菌混入样品，并且佩戴无菌手套，采样用小铲子、筛子、报纸及离心管等工具均经高压蒸汽灭菌后烘干。每一重复取样地采集质量相等的3个平行样品，充分混匀后过2 mm筛子，四分法取适量放于50 mL无菌离心管，与冰袋一起装入保温盒带回实验室于4 ℃保存。采集的样品经测定pH为4.79±0.09，含水量为4.83±0.46，每克干样中微生物总DNA质量为(640.03±70.95) ng，每克干样中细菌、真菌和放线菌的菌落数依次为(219.46±4.35)×10⁴，(0.54±0.12)×10⁴和(2.18±0.08)×10⁴。

1.2  仪器和材料

实验仪器包括DCode通用突变检测系统(Bio-Rad，美国)、高速低温离心机(Centrifuge 5417R) (Eppendorf，德国)、超低温冰箱(VEX-490)(Thermo，美国)、PCR仪(C1000^TM Thermal Cycler，Bio-Rad，美国)、凝胶成像仪(Gel Doc XR)(Bio-Rad，美国)和超微量分光光度计(Implen，德国)。

实验材料包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、溶菌酶、蛋白酶K、尿素、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、去离子甲酰胺、过硫酸铵(APS)，均购自美国AMRESCO公司；其余试剂均为分析纯，均购自北京化工厂。

1.3  微生物总DNA的提取

参照文献[14]提取DNA主要步骤如下：1) 将10 g样品加入12.50 mL DNA提取液(4.84 g Tris，1.8 mL HCl，80 mL 0.5 mol/L EDTA，35.46 g NaCl，4 g CTAB，15.21 g Na₃PO₄，pH=8.0，定容于500 mL)和500 μL溶菌酶(25 mg/mL)，充分涡旋后于37 ℃水浴1 h，每15 min轻柔颠倒混匀。2) 加入130 μL蛋白酶K(10 mg/mL)和650 μL SDS(质量浓度为200 g/L)，颠倒混匀。3) 液氮冷冻5 min后置57 ℃水浴20 min，颠倒混匀，此步骤连续进行3次。4) 在6 000 r/min转速下离心10 min，沉淀加入5 mL DNA提取液和25 μL SDS，混匀后于57 ℃水浴10 min，在6 000 r/min转速下离心10 min；合并2次离心上清液。5) 加入2次上清液总体积0.2倍的PEG 8 000(质量浓度为400 g/L)和2次上清液总体积0.4倍的NaCl(浓度为1.5 mol/L)，混匀后于4 ℃沉淀过夜。6) 在12 000 r/min转速下离心20 min，沉淀加入0.75 mL 1×TE溶解。7) 用与沉淀被溶解后总体积相等的酚+氯仿+异戊醇(体积比25:24:1)溶液抽提，于温度为4 ℃、转速为12 000 r/min离心20 min；再用与上清液体积相等的氯仿+异戊醇(体积比24:1)溶液抽提1次，于温度为4 ℃、转速为12 000 r/min离心20 min。8) 在上清液中加入上清液体积0.6倍的异戊醇(-20 ℃预冷)，于4 ℃沉淀过夜。9) 在4℃，12 000 r/min转速下离心20 min收集沉淀。10) 用70%(体积分数)乙醇洗涤2次，晾干后适量TE溶解得到微生物总DNA。

1.4  PCR-DGGE分析

提取样品微生物总DNA后，以338F(GC)：5’-(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和518R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’为引物，扩增200 bp左右的16S rDNA V3区，PCR体系50 μL：Takara Ex Taq(5 U/μL) 0.3 μL，10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺ Plus)5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol)4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 50 ng，用灭菌高纯水补至50 μL；PCR程序：首先于94 ℃预变性5 min，然后以94 ℃变性1 min、于48 ℃退火1 min、于72 ℃延伸1 min循环30次后，于72℃总延伸10 min，最后在4 ℃保存。DGGE变性范围为40%~65%，上样量为15 μL PCR产物，电泳体系为1×TAE Buffer，于60 ℃及70 V条件下电泳16 h。染胶使用1:10 000 SYBR Green。PCR产物回收纯化采用MiniBEST(TaKaRa)DNA片断纯化试剂盒。扩增产物使用通用型pUM-T快速克隆试剂盒(Bioteke)进行连接转化，感受态细胞为DH5α(Bioteke)，并以M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’和M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’为引物，以经氨基青霉素筛选后的大肠杆菌扩增菌液为模板，PCR验证阳性克隆。引物的合成以及阳性克隆扩增菌液质粒的提取和测序均由上海生工生物工程有限公司完成。DGGE条带序列与GenBank和EZTaxon比对，利用Clustal X和MEGA 4，以邻位连接(Neighbour-Joining)算法和p-distance模型构建系统发育树。并利用Quantity One(Bio-Rad)，以生态学3个α多样性指数：Simpson多样性指数(D)^[15]、Shannon-wiener多样性指数(H′)和Pielou均匀度指数(J)^[16]从不同侧面反映微生物的多样性：H′=-∑P_i(lnP_i)；D=1-λ；λ=∑P_i²；J=H′/H′_max。式中：P_i为i条带强度与该样品所有条带总强度的比值；H′_max=lnS；S为每一样品(泳道)DGGE图谱中的条带总数。

2  结果

2.1  DGGE分析

虽然DGGE指纹图谱的信号强度较弱(图1)，但从凝胶中依然检测到了13条可辨别有差异的条带。每个条带可能代表1种微生物，通常被记作1个OTU。

图1  PCR扩增产物的DGGE指纹图谱

Fig. 1  DGGE fingerprint profile of PCR amplified products

系统发育树表征了OTUs所代表的微生物与模式菌株的遗传进化关系，其分支是根据亲缘远近来划分的，同一个分支上的分离物代表它们亲缘关系较近。从图2可以看出：样品中的优势细菌种类共涉及变形菌门(α-，β-，γ-)、厚壁菌门和绿湾菌门3个细菌门类，其中α-和β-变形菌纲各3个OTUs，其中，α-变形菌纲的OTUs为条带11，5，10，β-变形菌纲的OTUs为条带12，9，8；γ-变形菌纲4个OTUs，即条带2，7，3和1；厚壁菌门2个OTUs，即条带4和6；以及绿湾菌门1个OTU，即条带13。

将各条带序列在GenBank中进行比对，结果见表1。一般认为相似度97%以上即为同种，相似度94%以上即为同属。从表1可以看出：α-变形菌纲的3个OTUs属于Altererythrobacter，Chelativorans和Sphingomonas菌属；β-变形菌3个OTUs属于Hydrogenophaga和Thiobacillus菌属；γ-变形菌4个OTUs属于Acinetobacter和Pseudomonas菌属；厚壁菌门2个OTUs属于Faecalibacterium和Bacillus菌属；绿湾菌门1个OTU，虽然根据其16S rDNA V3区序列以及基因数据库中目前已有的信息暂时无法确定其菌属种类，但是它与利用DGGE技术分离的北京苗圃土壤样品中的1株不可培养绿弯菌门细菌(JX215290)相似度达99%。

2.2  多样性指数分析

细菌群落的遗传多样性是长期进化的产物，是细菌生存适应和发展进化的前提。样品的H′，D和J分别为1.95，0.86和0.99。多样性指数J为0.99，说明样地受人为扰动较小，物种分布的均匀程度较高，菌群较稳定。指数H′一般在1.5~3.5之间，很少超过4.5，指数H′越大、指数D越接近1，意味着群落的遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。

图2  基于16S rDNA序列的系统发育树

Fig. 2  Phylogenetic tree based on 16S rDNA

表1  DGGE分离细菌的16S rRNA基因比对分析

Table 1  Blast analysis of bacterial 16S rRNA gene sequences obtained from DGGE

3  讨论

从图1可以看出：DGGE指纹图谱条带的信号强度较弱，这可能是提取样品的微生物总DNA所含杂质较多造成的，杂质对PCR扩增及后续分子操作产生了一定的影响，但每克干样的DNA粗体液中核酸质量达(640.03±70.95) ng。由此可见，对PCR影响的主要因素并非核酸含量，而主要在于残留的杂质不能有影响Taq DNA聚合酶活性的成分。DGGE指纹图谱中的分离条带共涉及变形菌门(α-，β-，γ-)、厚壁菌门和绿湾菌门。变形菌门细菌已经被证实可以有效降解石油烃类物质^[17]，并且在黑页岩^[18]、天然沥青^[19]、深海沉积物^[20]和沙地^[21]等许多极端环境中被广泛研究。β-proteobacteria降解有机物的能力非常强^[22-23]，其中，Hydrogenophaga对苯环效果尤其显著， Hydrogenophaga sp.可在被苯污染的砂岩地下水中被分离。α-proteobacteria大多数为寡营养类型，部分菌属对多氯联苯和五氯酚等有降解作用。γ-proteobacteria代谢类型多种多样，可以降烷烃、聚丙烯酰胺、多氯联苯、硝基苯解萘、苯酚和壬基酚等^[24]。Kilbane等^[25]利用Pseudomonas ayucida处理页岩油，结果发现68%的喹啉被降解。Truu等^[26]利用Pseudomonas sp.降解油页岩废渣中酚等化学物质，在1.5 a的时间内，酚类物质含量降低了35%，油类物质含量减少了2/3。Acinetobacter可以降解烷烃、脱硫、脱氮和产生表面活性等，它和Pseudomonas都是主要的微生物采油菌。厚壁菌具有独特的耐受性，在许多养分贫瘠的环境中普遍存在，其产生的生物表面活性剂可以帮助微生物细胞黏附于烃类物质表面进行解烃代谢。在硅酸盐矿石环境中可筛选出较多的有特定功能的芽孢杆菌，例如扭脱杆菌(Bacillus exlorgllen)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)和胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginous)^[27]，它们在生长过程中产生许多代谢产物使矿石中的硅酸盐矿物微粒分散到浸出液中，同时释放出硅酸盐组成成分中的磷、钾和硅等元素，达到降解硅酸盐的目的。绿弯菌门是一类通过光合作用产生能量的细菌，它们所产生的初级生产力对异养菌具有非常重要的作用。

样品pH为4.79±0.09，呈明显酸性，这可能与采样月份为7月，正值广东地区的雨季有关，首先，城市中大量使用的煤、石油、天然气等化石燃料，燃烧后产生的硫氧化物或氮氧化物随雨水侵袭到露天矿内；其次，油页岩中可能存在的部分游离态碳(该矿区油页岩样品的碳素质量分数达41.43%)也会溶解在雨水里，形成碳酸溶液；此外，在有机物转化的过程中，可能存在某些种类的微生物将部分小分子烃类转化成了有机酸。样品的指数H′和D分别1.95为0.86，说明群落细菌多样性总体较丰富。然而，每克样品中细菌、真菌和放线菌数仅为(219.46±4.35)×10⁴，(0.54±0.12)×10⁴和(2.18±0.08)×10⁴，这与油页岩本身性质有关。油页岩中养分低、杂质多，无机矿物质含量高于有机质含量，且有机质主要由复杂三维网状结构的干酪根构成，这些不利条件导致微生物数量较低；然而，微生物的数量少但种类并不少，这一发现与曹成有等^[28]对流动沙丘的研究结果一致，不利的环境条件主要导致微生物的生长和繁殖受到一定的抑制，由于对有限资源的竞争，可能会使少数种类成为优势种。

4  结论

1) 采样矿区土壤样品中细菌群落的门类共涉及变形菌门(α-，β-，γ-)、厚壁菌门和绿湾菌门，包括Altererythrobacter，Chelativorans，Sphingomonas，Hydrogenophaga，Thiobacillus，Acinetobacter，Pseudomonas，Faecalibacterium和Bacillus菌属细菌，以及绿湾菌门暂无法确定菌属的细菌。群落生态学H′，D和J多样性指数分别达1.95，0.86和0.99，物种多样性总体较丰富。

2) 特定的生态环境决定相应的微生物群落结构，微生物群落结构又会影响微生物生存的环境。油页岩矿区土壤本源微生物的代谢功能在长期进化中逐渐与油页岩环境相适应，从而有可能具有代谢含多种官能团和有多种化学键的古代有机质的能力，因此，未来在生物浸溶转化油页岩的实际培养和生产过程中，应根据需要，合理搭配本源菌种，特别是变形菌门和厚壁菌门的某些种类，应作为基本的代谢降解菌种。

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(编辑  赵俊)

收稿日期：2014-12-06；修回日期：2015-03-05

基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金资助项目(51204055)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(N130420002)；中国博士后科学基金资助项目(20100481205)(Project (51204055) supported by the National Natural Science Foundation of China; Project (N130420002) supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities; Project (20100481205) supported by the China Postdoctoral Science Foundation)

通信作者：薛向欣，博士，教授，博士生导师，从事冶金新工艺理论与环保技术研究；E-mail：xuexx@mail.neu.edu.cn