简介概要

不同钙磷比对激光熔覆生物陶瓷涂层微观结构性能与细胞活性的影响

来源期刊：稀有金属2017年第10期

论文作者：白杨刘其斌徐鹏朱益志张时维

文章页码：1112 - 1116

关键词：n(Ca)∶n(P);激光熔覆;生物陶瓷涂层;细胞活性;

摘要：激光熔覆过程中医用钛合金与混合粉末（CaHPO₄·2H₂O+CaCO₃+La₂O₃）因热膨胀系数相差大而容易产生裂纹、气孔等缺陷,故采用梯度设计方法在医用钛合金表面上制备一层具有生物活性的磷酸钙陶瓷涂层。通过金相显微镜（OM）,X射线衍射仪（XRD）,显微硬度计,甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和倒置荧光显微镜对稀土氧化物La₂O₃添加量相同（0.6%）的不同钙磷比激光熔覆磷酸钙陶瓷涂层结合界面、物相、显微硬度、细胞相对活性和细胞生长状态进行分析。试验结果表明:通过OM观察其横截面积可以看出熔覆试样分为基材、合金化层及陶瓷层3个区域,各区域间呈良好的冶金结合。在2θ在32°³3°附近,当n（Ca）∶n（P）（原子比）=1.40¹.45时,其XRD图谱中羟基磷灰石+β-磷酸三钙（HA+β-TCP）的特征峰较高,表明其生成的生物活性相HA+β-TCP的量最多。显微硬度结果表明n（Ca）∶n（P）值越大,涂层平均硬度越高。MTT比色法和倒置荧光显微镜观察结果表明当涂层n（Ca）∶n（P）=1.40时,吸光度值（OD）最大,生物陶瓷涂层上细胞数量最多且生长状态良好,表明该涂层具有最佳的细胞相容性且有利于细胞的稳定增殖与生长。

网络首发时间: 2016-08-30 17:03

稀有金属 2017,41(10),1112-1116 DOI:10.13373/j.cnki.cjrm.xy16060014

不同钙磷比对激光熔覆生物陶瓷涂层微观结构性能与细胞活性的影响

白杨刘其斌徐鹏朱益志张时维

贵州大学材料与冶金学院

贵州省材料结构与强度重点实验室

摘要：

激光熔覆过程中医用钛合金与混合粉末 (CaHPO₄·2H₂O+CaCO₃+La₂O₃) 因热膨胀系数相差大而容易产生裂纹、气孔等缺陷, 故采用梯度设计方法在医用钛合金表面上制备一层具有生物活性的磷酸钙陶瓷涂层。通过金相显微镜 (OM) , X射线衍射仪 (XRD) , 显微硬度计, 甲基噻唑基四唑 (MTT) 比色法和倒置荧光显微镜对稀土氧化物La₂O₃添加量相同 (0.6%) 的不同钙磷比激光熔覆磷酸钙陶瓷涂层结合界面、物相、显微硬度、细胞相对活性和细胞生长状态进行分析。试验结果表明:通过OM观察其横截面积可以看出熔覆试样分为基材、合金化层及陶瓷层3个区域, 各区域间呈良好的冶金结合。在2θ在32°³3°附近, 当n (Ca) ∶n (P) (原子比) =1.40¹.45时, 其XRD图谱中羟基磷灰石+β-磷酸三钙 (HA+β-TCP) 的特征峰较高, 表明其生成的生物活性相HA+β-TCP的量最多。显微硬度结果表明n (Ca) ∶n (P) 值越大, 涂层平均硬度越高。MTT比色法和倒置荧光显微镜观察结果表明当涂层n (Ca) ∶n (P) =1.40时, 吸光度值 (OD) 最大, 生物陶瓷涂层上细胞数量最多且生长状态良好, 表明该涂层具有最佳的细胞相容性且有利于细胞的稳定增殖与生长。

关键词：

n (Ca) ∶n (P) ;激光熔覆;生物陶瓷涂层;细胞活性;

中图分类号： TQ174.1

作者简介：白杨 (1991-) , 男, 辽宁省营口人, 硕士, 研究方向:生物医用复合材料, E-mail:834838199@qq.com:;刘其斌, 教授, 电话:13608553484, E-mail:qbliu2@263.net;

收稿日期：2016-06-08

基金：国家自然科学基金项目 (51362004) 资助;

Properties and Cell Activity of Bioceramic Coating Fabricated by Laser Cladding with Different Ca∶P Ratios

Bai Yang Liu Qibin Xu Peng Zhu Yizhi Zhang Shiwei

College of Materials and Metallurgy, Guizhou University

Key Laboratory for Material Structure and Strength of Guizhou Province

Abstract：

Due to the difference of thermal expansion coefficient between medical Ti alloy and mixed powder ( CaHPO₄·2H₂O + CaCO₃+ La₂O₃) in the process of laser cladding, it was easy to produce cracks, pores and other defects. Therefore, bioactive calcium phosphate coating was prepared on the surface of medical Ti alloy by using gradient design method. The bonding interface, phases, microhardness, bioactivity and cell growth morphology of different n ( Ca) ∶ n ( P) calcium phosphate ceramic coating doped with the same amount of rare earth oxide La₂O₃ were characterized by optical microscope ( OM) , X-ray diffraction ( XRD) , microhardness instrument, methyl thiazolyl tetrazolium ( MTT) assay and inverted fluorescence microscope. The experimental results indicated that the cross section of cladding samples observed by OM consisted of substrate, alloying layer and bioceramic coating. There was an excellent metallurgical bonding among layers. When n ( Ca) ∶ n ( P) was 1. 40 ~ 1. 45, the peak of hydroxyapatite + β-Ca₃ ( PO₄) ₂ ( HA + β-TCP) reached the maximum diffraction intensity at 2θ = 32° ~ 33° in the XRD pattern, indicating that mostbiologically active phases β-TCP +HA were synthesized. The microhardness results showed that the higher the n ( Ca) ∶ n ( P) value, the higher the average hardness of the coating was. MTT assay and inverted fluorescence microscope observation results indicated that when n ( Ca) ∶ n ( P) was 1. 40, OD value reached the maximum and the relative number of cells on the bioceramic coating was the maximum and the cell growth morphologies were in good condition, indicating that this kind of coating has better biocompatibility and was conducive to the stable proliferation and growth of cells.

Keyword：

n (Ca) ∶n (P) ; laser cladding; bioceramic coating; cell activity;

Received： 2016-06-08

生物活性陶瓷是目前研究较多的生物活性材料, 具有极佳的生物活性, 在现代生物医学领域中受到人们极大关注^[1,2,3]。但是由于生物陶瓷脆性大, 强度低, 限制了在人体荷重部位的使用。刘其斌课题组采用梯度设计方法利用激光熔覆技术在力学性能优良的医用钛合金表面上制备出一层具有生物活性的陶瓷涂层。不仅巧妙地避免了基材与涂层之间因热膨胀系数差异大而产生裂纹、气孔等缺陷, 还在医用钛合金表面上制备出既具有良好的生物活性又具有优秀综合力学性能的磷酸钙陶瓷涂层^[4,5,6,7]。

目前很多学者已经对不同单一或混合稀土氧化物对生物陶瓷涂层的影响进行了分析与总结^{[8,9,10,11,12,13]}, 但从不同钙磷比对生物陶瓷涂层影响进行分析却鲜有报道。刘其斌课题组研究发现当稀土氧化物La₂O₃添加含量为0.6% (质量分数, 下同) 时, 羟基磷灰石+β-磷酸三钙 (HA+β-TCP) 生成量最多, 生物陶瓷涂层具有最佳的生物活性。因此本文中在不同钙磷比粉末中添加La₂O₃的含量都为0.6%, 研究不同钙磷比对激光熔覆磷酸钙陶瓷涂层微观结构性能与生物活性的影响, 优化出最佳的钙磷比陶瓷涂层。

1实验

1.1材料

基体材料为医用钛合金 (Ti-6Al-4V) , 熔覆粉末为分析纯Ca HPO₄·2H₂O, Ca CO₃和La₂O₃以及45~50μm粉末粒度的Ti粉, 二甲基亚砜 (DM-SO) , 细胞系MG63, DMEM培养基, 标准小牛血清, 双抗, 荧光素乙酰乙酸盐 (FDA) 。

1.2方法

本文中激光熔覆实验所使用仪器为TFL-H10000型10 k W横流CO₂激光器。因为粉末与基材的线膨胀系数、熔点等参数相差较大, 直接熔覆易产生裂纹。因此对熔覆层进行梯度成分设计 (表1) , 以改善涂层与基材的结合强度。理论上羟基磷灰石的钙磷原子比是1.67, 但是在激光熔覆过程中Ca和P都存在损烧, 尤其是P的损烧更为严重, 故对混合粉末进行不同钙磷比设计, 取n (Ca) ∶n (P) (原子比) 值为1.35, 1.40, 1.45和1.50进行分析。

表1 生物陶瓷涂层成分设计Table 1 Compositional design of bioceramic coating (g) 下载原图

表1 生物陶瓷涂层成分设计Table 1 Compositional design of bioceramic coating (g)

用金相砂纸打磨去掉基材表层氧化皮, 酒精清洗干净, 采用激光熔覆工艺, 涂敷第一层粉末厚度为0.5 mm左右, 用钢刷和酒精清理表面后再熔覆第二梯度层, 相同方法再熔覆第三梯度层, 从而在医用钛合金表面上制备出梯度活性生物陶瓷涂层。优选的激光熔覆工艺参数为输出功率P=1.8 k W, 扫描速度v=240 mm·min^-1, 光斑直径D=3.5 mm。将熔覆好的试样线切割成10 mm×10 mm×3 mm的样品, 石油醚、丙酮、酒精和蒸馏水依次清洗干净, 不同记号分组放在干燥箱里备用。

1.3仪器

不同组试样处理后, 用OLYMPUS GX51型号金相显微镜 (OM) 观察其横截面金相组织;采用D/Max-2200型X衍射测试仪 (XRD) 分析涂层物相;用DHV-1000Z型号显微硬度计对磷酸钙陶瓷涂层进行显微硬度分析。

1.4 MTT比色法和倒置荧光显微镜观察

将清洗干净的试样从干燥箱中取出, 放入金属饭盒高温灭菌后使用。每组3个平行样, 放入24孔板并在每孔加入1 ml含有MG63细胞的DMEM培养基中, 细胞接种密度为每毫升1×10⁴个, 设置2, 4, 6 d 3个时间点, 每2 d换一次培养基。使用倒置荧光显微镜对用FDA^[14]染色后的细胞生长形态进行观察;使用THERMO Varioskan Flash全波长多功能酶标仪测量各组样品不同时间的吸光度值 (OD值) 。

2结果与讨论

2.1磷酸钙生物陶瓷涂层的组织形貌分析

梯度设计思想激光熔覆的生物陶瓷涂层界面形貌如图1所示, 以n (Ca) ∶n (P) =1.40举例。激光熔覆后的磷酸钙陶瓷涂层分为基材、合金化层和陶瓷涂层3个层次, 各层间结合界面为良好的化学冶金结合且整体上只有极少数微小裂纹, 表明各层间界面结合良好。少量小裂纹和小孔洞的存在可以为骨细胞提供良好的生长通道, 使植入体与人体组织形成牢固的生物键合。基材与生物陶瓷层之间存在致密的合金化层, 其将作为一道屏障有效的阻碍杂质如Al, V等有害离子游离出来, 对生物体起到保护作用。

图1 梯度生物陶瓷涂层横截面形貌Fig.1 Cross section morphology of gradient bioceramic coating

2.2磷酸钙陶瓷涂层的物相分析

图2给出了不同钙磷比磷酸钙陶瓷涂层X射线衍射图谱, 涂层中稀土La₂O₃的含量都为0.6%。从衍射图谱中可以看出, 经过激光熔覆的磷酸钙陶瓷涂层主要含有HA, β-TCP, Ti O₂, Ca Ti O₃等物相。在2θ为32°~33°附近, n (Ca) ∶n (P) =1.40~1.45时, 其XRD图谱中β-TCP+HA的特征峰较高, 表明其生成的生物活性相β-TCP+HA的量最多。羟基磷灰石 (HA) 是人体骨骼主要的无机成分, 含有人体组织所必需的钙和磷元素。β-TCP^[15]是优良的生物活性降解材料, 与人体骨骼无机成分相似且具有无毒副作用, 易生物降解吸收等特性。

图2 不同钙磷比生物陶瓷涂层的X射线衍射图谱Fig.2 XRD patterns of bioceramic coating with different ratios of n (Ca) ∶n (P)

综上所述, 当稀土氧化物La₂O₃添加含量为0.6%, n (Ca) ∶n (P) =1.40~1.45时, 经过激光熔覆后的磷酸钙陶瓷涂层中β-TCP+HA生成量最大, 表明其生物陶瓷具有最佳的生物医学效果。

2.3不同钙磷比磷酸钙陶瓷涂层显微硬度分析

为了进一步探究不同钙磷比激光熔覆磷酸钙陶瓷涂层与硬度之间的关系, 进行了显微硬度分析, 得到的显微硬度曲线如图3所示。由于表面有氧化层的存在, 所以开始时硬度值不是太高。从陶瓷层至基材, 硬度曲线大致呈梯度上升再下降趋势, 合金化层区域硬度值达到峰值, 高硬度保证了生物陶瓷有足够高的强度来承受人体荷重。当n (Ca) ∶n (P) =1.50时, 其磷酸钙陶瓷涂层平均显微硬度最大, 合金化区域最高硬度值达到HV 2434。当n (Ca) ∶n (P) =1.35时, 其平均硬度远低于n (Ca) ∶n (P) =1.50时的磷酸钙陶瓷涂层。当n (Ca) ∶n (P) =1.40~1.45时, 其硬度曲线分布介于2者之间。

以上分析表明磷酸钙陶瓷涂层的硬度分布与不同钙磷比含量有关。钙磷比越大, 平均硬度越高。其原因应该是, 当稀土氧化物添加量相同, 钙磷比越大时, 表明其涂层中钙原子数量越大, 为结晶提供大量形核质点, 结晶相对均匀, 其表面就越平整, 致密度越高, 平均硬度也就越大。

图3 不同钙磷比磷酸钙生物陶瓷涂层显微硬度分析Fig.3 Microhardness curve analysis of bioceramic coating with different ratio of n (Ca) ∶n (P)

2.4 MTT分析

图4为成骨细胞MG63接种在不同钙磷比磷酸钙陶瓷涂层上, 采用MTT法^[16]测出的2, 4, 6 d3个时间点OD值的柱状图。从图4可知, 随着细胞培养时间的延长, 细胞增殖稳定, 证明了磷酸钙陶瓷涂层不仅无毒而且具有较好的细胞活性。从3个时间点来看, 当n (Ca) ∶n (P) =1.40时, OD值最高, 最适合细胞的稳定增殖与生长。

2.5倒置荧光显微镜分析

图5为不同钙磷比陶瓷涂层与MG63共培养4 d时的荧光染色结果分析图片, 细胞是由FDA染色。因为FDA只能染活细胞, 呈现绿色, 所以生物陶瓷涂层上细胞数目和生长形态可以间接反映出不同钙磷比陶瓷涂层上生物活性的高低。由图5 (a) ~ (d) 可以看出, 细胞生长形态都较好且很好地铺展开来, 也证明了陶瓷涂层能够很好地为细胞所接受, 适合细胞的稳定增殖与生长。当陶瓷涂层中n (Ca) ∶n (P) =1.40和n (Ca) ∶n (P) =1.45时, 细胞在其表面上数目较多生长形态也较好, 说明当n (Ca) ∶n (P) =1.40~1.45的磷酸钙陶瓷涂层细胞相容性最佳。