细柱五加叶中抗HMGB1总三萜活性物质的闪式提取工艺

刘向前^{1, 2}，郑礼胜¹，翁柳娜¹，邹方卉¹，李丽丽¹

(1. 中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；

2. 湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙，410208)

摘要：采用闪式提取，通过二次通用旋转实验设计优化细柱五加叶中三萜类物质的提取工艺，以综合评分为指标，考察乙醇浓度、提取时间、溶剂用量3个主要因素对工艺的影响；确定出最佳提取工艺，用UV法检测提取物中的总三萜成分含量。实验结果表明最佳提取工艺为：53%(体积分数)乙醇为溶剂，闪式提取175 s；该工艺稳定，重现性好(相对标准偏差为0.77%)，操作简单、省时，以五加皂苷为对照品，饱和NaHCO₃溶液为溶剂，以218 nm为最适波长时，线性范围为0.01~0.07 g/L(相关系数为0.999 6)，加样回收率为98.2%(相对标准偏差为1.23%)。

关键词：细柱五加；五加皂苷；二次通用旋转实验设计；三萜成分；闪式提取法；紫外光谱

中图分类号：R284.2；R286.02          文献标志码：A         文章编号：1672-7207(2011)07-1890-09

Smashing tissue extraction of active triterpenoids of anti-HMGB1 from leaves of Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith

LIU Xiang-qian^{1, 2}, ZHENG Li-sheng¹, WENG Liu-na¹, ZOU Fang-hui¹, LI Li-li¹

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;

2. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

Abstract: Smashing tissue extraction was used to distill the active triterpenoids of anti-HMGB1 from AGS, and the quadratic general rotary unitized design was used to optimize the extraction process. Taking the overall score as the target, the influences of ethyl alcohol concentration, the extraction time and the solvent amount on extraction process were studied. Finally, the optimal extraction technological conditions were determined. The triterpenoids in extraction was determined by UV. The results show that the optimal condition is taking 53% ethyl alcohol as the solvent and distilling for 175 s. This craft is stable and the reproduction quality is good (the relative standard deviation (RSD) is 0.77%), also the operation is simple and takes shorter time. Using acankoreanogenin A as comparison, saturation NaHCO₃ as solvent and the most suitable wavelength is 218 nm, the liner range is 0.01-0.07 g/L (R=0.999 6) and the recovery of acankoreanogenin A is 98.2% (RSD is 1.23%).

Key words: Acanthopanax gracilistylus W.W. Smith; acankoreoside A; quadratic general rotary unitized design; triterpenoids; smashing tissue extraction; ultraviolet

五加科五加属植物大都具有很强和广泛的药食用价值，如滋补、抗风湿、抗应激、抗疲劳、抗肿瘤等作用，中、日、韩三国都已把它列入各自国家的药典中，临床用于治疗风湿痹痛、腰膝软弱等病症^[1-6]。倪娜等^[6-7]对细柱五加叶中的三萜类成分进行了系统研究，分离出了多个lupane型三萜成分，并对它们进行了抗HMGB1活性筛选，结果显示，五加苷元acankoreanogenin A和五加皂苷acankoreoside A均有较强的抗HMGB1活性，有望成为一种抗HMGB1新药。二次通用旋转试验设计是正交回归组合设计的一种，它克服了二次回归预测值的方差强烈地依赖于实验点在因子空间中的位置这个缺点，可由预测值直接寻找最优区域；采用回归旋转设计实验方法，使在与实验中心点距离相等的点上具有相同的方差，消除了回归系数间的相关性，从而使实验次数大大缩减，计算简便，易于得到多因素的较优组合及变化趋势。由于其具有准确性高、综合性好、系统性强、信息量大等优点，被广泛应用于生产试验和科学试验^[8-10]。我国有丰富的细柱五加资源，为新药开发提供了充足的资源保障，但目前尚无其叶中三萜成分的提取工艺和定量研究报道。本文作者采用闪式提取法，通过二次通用旋转实验设计优化其工艺，并确定了UV法测定提取物中总三萜成分含量的条件。

1  材料与方法

1.1  材料、试剂与仪器

材料为细柱五加叶，2008年11月采自湖南，经鉴定为细柱五加(Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)叶，阴干。标本存于中南大学制药工程系标   本室。

试剂为五加皂苷、五加苷元对照品，由本研究室自制，经1D和2D-NMR等光谱鉴定后，HPLC测定其含量＞99.0%，甲醇、乙醇、NaHCO₃均为分析纯。

仪器为：JHBE-20A型闪式提取器(北京金鼐科技有限公司生产)，752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司生产)，TG328A型物理天平(湘仪天平仪器厂生产)，DZF-6020型真空干燥箱(上海精密仪器实验设备有限公司生产)，202-0型电热恒温干燥箱。

1.2  实验方法

1.2.1  提取方法

取细柱五加叶8.0 g，剪成小块(直径＜5.0 mm)，加提取剂适量，闪式提取^[11-12]，抽滤，回收溶剂，浓缩，干燥，得干膏。对水分含量进行测定^[1]，计算干膏得率。

采用三因子五水平二次通用旋转实验设计^[13-14]安排实验，所选因素及水平见表1。实验方案及结果见表2。

1.2.2　总三萜成分的测定

(1) 波长选择。取五加皂苷和五加苷元对照品各10 mg，精密称定，分别置于100 mL容量瓶中，加适量饱和NaHCO₃溶液^[15]，超声溶解，定容，摇匀，得皂苷和苷元对照品的饱和NaHCO₃溶液。以饱和NaHCO₃溶液为空白样，在190~400 nm波长下扫描，皂苷和苷元最大吸收波长分别为218和214 nm。但在饱和NaHCO₃溶液中皂苷比苷元更易溶解，且溶液较稳定，故选择五加皂苷为测定用的对照品，检测波长为218 nm。

表1　因素水平表

Table 1　Factors and coded levels

 (2) 对照品溶液的配制。取五加皂苷对照品10 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，饱和NaHCO₃溶液溶解，定容，摇匀，即得五加皂苷对照品溶液，并测得它的紫外光谱，见图1。

(3) 供试品溶液的配制。取1.2.1项下的样品干膏0.1 g左右，精密称定，加适量饱和NaHCO₃溶液，超声溶解，冷却，定容至100 mL，并测得它的紫外光谱，见图2。

(4) 标准曲线的绘制。分别精密移取五加皂苷对照品溶液1，2，3，4，5，6，7 mL于7只10 mL容量瓶中，饱和NaHCO₃溶液定容，测定218 nm处吸光度。五加皂苷对照品溶液的标准曲线如图3所示。

从图3可见：在0.01~0.07 g/L范围内，五加皂苷浓度与吸光度成线性，拟合曲线Y=12.275X+0.042 14，相关系数为R=0.999 6。

(5) 精密度实验。取五加皂苷对照品溶液，稀释2.5倍，以饱和NaHCO₃溶液做空白样，218 nm下测定其吸光度，重复5次；相对标准偏差RSD为0.67%，表明仪器精密度高。

(6) 重现性实验

取表2中16号样品5份，配制供试品溶液；以饱和NaHCO₃溶液做空白样，在波长为218 nm下分别测定其吸光度，RSD为1.22%，表明该方法可靠。

(7) 稳定性实验。取表2中16号样品配制供试品溶液；以饱和NaHCO₃溶液做空白样，在波长为218 nm下每隔1.5 h测量1次吸光度，共5次，RSD为0.74%，表明样品在6 h内稳定，满足含量检测要求。

表2　三因素二次通用旋转实验设计及结果

Table 2　Three-factor second order rotation combination experimental design and results

图1  五加皂苷对照品的紫外光谱

Fig.1  UV spectrum of standard acankoreoside A

 (8) 加样回收实验。取表2中17号样品0.05 g左右5份，精密称定，分别加入一定量的五加皂苷标准品，配制供试品溶液；以饱和NaHCO₃溶液做空白样，218 nm下分别测定吸光度，计算总皂苷含量，并计算出回收率为98.2%，RSD为1.23%，表明该方法回收率较高。

图2  样品中五加皂苷的紫外光谱

Fig.2  UV spectrum of acankoreoside A in sample

 (9) 总三萜成分提取率的测定。制备供试品溶液；以饱和NaHCO₃溶液做空白样，测定218 nm下各样品的吸光度，根据标准曲线计算总三萜成分浓度；再根据干膏量，计算出总三萜成分提取率。

图3  五加皂苷的标准曲线

Fig.3  Calibration curve of acankoreoside A

2　结果与分析

2.1  回归模型的建立及显著性检验

三因素二次通用旋转实验设计及结果见表2。

以综合评分Y为因变量，3因素X_i的编码值为自变量，对实验所得数据(见表2)进行多元分析，得回归方程：

Y=16.387 352-1.755 106X₁-0.394 956X₂+0.268 040X₃+

0.458 125X₁X₂+0.210 375X₁X₃-0.029 875X₂X₃+

0.751 501X₁²-0.441 210X₂²+0.077 806X₃²

对上述方程及各因素的方差分析见表3。

由表3可以看出：失拟检验F₁=-0.125 07＜F_0.05(5,5)=5.05，差异不显著，说明未控制因素对实验结果干扰很小，拟合不足被否定；拟合检验F₂= 165.301 55＞F_0.01(9,10)=4.95，达到极显著水平；复相关系数R²=0.993 3，校正复相关系数R_adj²=0.987 3，均说明该方程与实际情况拟合良好，正确反映了综合评分与乙醇浓度、提取时间和提取剂用量与五加叶质量之比的关系。

各实验因子的偏回归系数的检验结果表明：X₁，X₂，X₃，X₁X₂，X₁²，X₂²，X₃²的偏回归系数均达到极显著水平，这些因素对综合评分的影响极显著，而且不是简单的线性关系；交互项X₂X₃未达到显著水平，但由于各系数间具有相关性，微弱的交互项原则上不能删除，因此，方程不能简化^[16]。

2.2  主因子效应分析

由于回归模型本身已经过无量纲编码代换，其偏回归系数已经标准化，故可直接从其绝对值来判断各因子对目标函数的相对重要性，即一次项系数的绝对值可反映3因素对综合评分的影响程度，由回归方程可知3因素的影响程度从大到小依次为：乙醇浓度，提取时间，提取剂用量与五加叶质量之比。

表3  试验结果方差分析表

Table 3  Analysis of mean square deviation for experiment data

2.3  单因子效应及其边际效应分析

分别将回归方程中的2个变量固定在零水平，进行降维分析，即可得到3个以其中1个因素为决策变量的偏回归模型：

Y₁=16.387 352-1.755 106X₁+0.751 501X₁²

Y₂=16.387 352-0.394 956X₂-0.441 210X₂²

Y₃=16.387 352+0.268 040X₃+0.077 806X₃²

根据单因子效应方程作图，得到单因子效应曲线(图4)。经计算，当X₁=-1.682，X₂=-0.4476，X₃=1.682，即乙醇浓度为53%，提取时间为213 s，提取剂用量与五加叶质量之比为46.8时，各单因素对综合评分的影响最大，最大值分别为Y_1max=21.465，Y_2max=16.476，Y_3max=17.058。

图4  单因子效应曲线

Fig.4  Single factor utility curves

对单因子效应方程求一阶偏导数，得到单因子边际效应方程。单因子边际效应方程反映了综合评分随不同因子编码值的变化速率。单因子效应方程为：

dY₁/X₁=-1.755 1+1.503 16X₁

dY₂/X₂=-0.394 95-0.882 62X₂

dY₃/X₃=0.268 04+0.155 56X₃

根据单因子边际效应方程可以得到单因子边际效应曲线(图5)。由图5可知，3条曲线斜率的绝对值依次为：X₁＞X₂＞X₃，说明乙醇浓度的变化对综合评分的影响最大，提取时间次之，提取剂用量与五加叶质量之比最小，与主因子效应分析结果一致。

图5  单因子边际效应曲线

Fig.5  Marginal utility curves

2.4  因子的交互效应分析

为了观察2个因素同时对综合评分的影响，可以进行降维分析。令其中1个因素的水平为0，就可得到另外2个因素对综合评分影响的二元二次方程：

Y₁₂=16.387 352-1.755 106X₁-0.394 956X₂+

0.458 125X₁X₂+0.751 501X₁²-0.441 210X₂²

Y₁₃=16.387 352-1.755 106X₁+0.268 040X₃+

0.210 375X₁X₃+0.751 501X₁²+0.077 806X₃²

Y₂₃=16.387 352-0.394 956X₂+0.268 040X₃-

0.029 875X₂X₃-0.441 210X₂²+0.077 806X₃²

根据方程分别绘制响应面三维图和等高线图，结果如图6~11所示。

图6  乙醇浓度和提取时间响应面图

Fig.6  Response of surface of alcohol level and extraction time

图7  乙醇浓度和提取时间等高线图

Fig.7  Contour line of alcohol level and extraction time

图8  乙醇浓度和提取剂用量与五加叶质量之比响应面图

Fig.8  Response of surface of alcohol level and extracting agent concentration

图9  乙醇浓度和提取剂用量与五加叶质量之比等高线图

Fig.9  Contour line of alcohol level and extracting agent concentration

图6和图7反映了乙醇浓度X₁和提取时间X₂之间的交互作用。当X₂处于编码值范围内时，Y随X₁的减小而显著增大；当X₁处于低编码值范围内时，Y随X₂的减小也呈增大趋势；因此，乙醇浓度和提取时间两者具有显著协同作用。

图10  提取时间和提取剂用量与五加叶质量之比响应面图

Fig.10  Response of surface of extraction time and extracting agent concentration

图11  提取时间和提取剂用量与五加叶质量之比等高线图

Fig.11  Contour line of extraction time and extracting agent concentration

图8和图9反映了乙醇浓度X₁和提取剂用量与五加叶质量之比X₃的交互作用。当X₃处于编码值范围内时，Y随X₁的减小而显著增大；当X₁处于较低编码值范围内时，Y随X₃的减小只有微弱变化；因此，乙醇浓度和提取剂用量与五加叶质量之比两者之间的协同作用不明显。

图10和图11反映了提取时间X₂和提取剂用量与五加叶质量之比X₃的交互作用。由于交互项X₂X₃未达到显著水平，故不进行具体讨论。

2.5  数学模型寻优

利用回归方程，在试验约束区域内(-1.682≤ X₁≤1.682，-1.682≤X₂≤1.682，-1.682≤X₃≤1.682)，取步长为0.116，通过MATLAB编程，进行计算机模拟仿真选优(实验次数N=30)，得到27 000套方案的模拟结果，从中筛选出综合评分≥22.000的组合方案326套，占1.21%，X_i的频率分布解析见表4。

由表4可以看出，当X₁为-1.682，X₂=-1.278 3~ -0.927 1，X₃=-0.558 4~0.408 2时，综合评分有95%的可能性高于22.000。此时，相应的解码值为：乙醇浓度为53%，提取时间为163.3~184.4 s，提取剂用量与五加叶质量之比为24.4~34.1。

表4  综合评分≥22.000的优化提取方案中X_i取值频率分布

Table 4  Probability distribution of X_i in combined application

2.6  最佳工艺参数的确定与回归模型的验证

考虑到可操作性及贴近实际工业化生产，将最优提取条件定为：乙醇浓度53%，提取时间175 s，提取剂用量与五加叶质量之比为30 mL/g。

为验证上述优选出来的工艺，按数据分析得出的最优提取条件进行验证实验，结果如表5所示。

表5　最佳工艺验证实验结果

Table 5  Confirmatory experiment result of the best technique

由表5可知：该工艺的综合评分为22.292，RSD= 0.77%。与表2实验结果相比，该工艺的综合评分高于优化实验中的任何一组，且该工艺稳定，重现性好，操作简单、省时。

3  讨论

闪式提取法是中药提取领域的一项新技术，其原理是在适当溶剂存在下，利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的化学成分(或有效成分)与溶剂充分接触，使有效成分快速溶解转移，在很短时间内达到内外溶解平衡，然后过滤即可。其所用时间仅为常规回流提取的数十至数百分之一，而且避免了不耐热成分的破坏，且收率高，操作简便，节约溶剂和能源^[11-12]。

在溶剂和波长的选择中，分别考察了甲醇法和NaHCO₃饱和溶液法^[15]。结果发现：甲醇法波长扫描后得到的是倒峰，没有出现特定吸收峰，故不能选择甲醇作为测定细柱五加叶中三萜类物质的溶剂；在NaHCO₃饱和溶液中，五加皂苷的最大吸收峰(218 nm)与其苷元的(214 nm)非常接近，不能同时或分别测定它们的含量，只能测定三萜成分的总含量。研究表明，叶中皂苷含量远大于苷元含量^[6]，皂苷在饱和NaHCO₃溶液中比苷元易溶，且溶液较稳定，故选择五加皂苷为测定用的对照品，检测波长为218 nm。

4  结论

(1) 采用闪式提取法提取细柱五加叶中三萜成分，并用二次通用旋转实验设计优化其提取工艺，结果得到最佳工艺如下：乙醇浓度为53%，提取剂用量与五加叶质量之比为30 mL/g，提取时间为175 s。验证实验结果表明：该工艺稳定，重现性好，操作简单、省时。

(2) 确定了UV法测定细柱五加叶及其提取物中总三萜成分的方法为以五加皂苷为对照品，饱和NaHCO₃溶液为溶剂，218 nm为最适波长。该方法稳定可靠，易于操作，可用于细柱五加叶、五加皮以及其同属植物中总三萜成分含量的测定。

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(编辑 赵俊)

收稿日期：2010-08-20；修回日期：2010-11-02

基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司留[2005]55号)；湖南中医药大学科研启动基金(48010101-7)；中南大学研究生创新项目(2009ssxt046)

通信作者：刘向前(1967-)，男，湖南长沙人，博士，教授，从事中药及天然药物活性成分研究、中药单复方制剂研究；电话：0731-88995848；E-mail: lxq0001cn@163.com