纳米二氧化钛对尿素酶活性的增强效应

司士辉， 李  赛，杨政鹏，谢亚林

 (中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083)

摘　要：分别用粒径为5 nm，25 nm和2.4 μm的TiO₂吸附尿素酶。在35 ℃，pH为7的条件下采用电位法测定吸附在TiO₂上的尿素酶的活性变化。基于纳米TiO₂膜的pH响应，制备尿素酶/纳米TiO₂复合膜电极。研究结果表明：纳米TiO₂对尿素酶的活性有明显的增强效应，其游离酶及TiO₂(粒径分别为5 nm，25 nm和2.4 μm)固载酶的米氏常数分别为0.45，0.22，0.28和0.31 mol/L。该复合电极对尿素的检测范围为8.5×10^-5~0.15 mol/L，相关系数为0.993 73，检出限为5×10^-6 mol/L，其使用寿命在35 d后仍能维持38％。

关键词：纳米TiO₂；酶吸附；尿素酶；复合电极

中图分类号：O614.41⁺1         文献标识码：A         文章编号：1672-7207(2007)04-0692-04

Enhancement of urease activity by TiO₂ nanoparticles

SI Shi-hui, LI Sai, YANG Zheng-peng, XIE Ya-lin

 (School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Abstract: The urease was adsorbed on TiO₂ with different particle sizes(5 nm, 25 nm, 2.4 μm). Under conditions of    35 ℃ and pH=7, the activity of urease absorbed on TiO₂ particles was measured by potentiometry. Based on the pH response of nano-TiO₂ film, a urease/nano-TiO₂ complex films electrode was developed. The results show that the activity of urease can be enhanced by being adsorbed on nanostructure materials, and the Michaelis-Menton constant of free and urease adsorbed on different particles sizes of TiO₂ (5 nm, 25 nm, 2.4 μm) are 0.45, 0.22, 0.28 and 0.31 mol/L, respectively. The complex films electrode is sensitive to urea in the linear range 8.5×10^-5-0.15 mol/L, the correlation coefficient and the detection limit are 0.993 73 and 6×10^-5 mol/L, respectively. The lifetime of the urease/nano-TiO₂ complex films electrode can remain 38% after 35 d.

Key words: nano-titanium oxide; enzyme adsorption; urease; complex films electrode

纳米材料由于其尺寸很小，结构特殊，因此具有许多独特的物理化学特性，如小尺寸效应，比表面积大，反应活性高，量子效应等^[1-3]。近年来，随着纳米技术的发展，纳米材料的生物效应引起了人们的关  注^[4-7]。目前，人们已对纳米TiO₂，SiO₂，碳纳米管和纳米铁粉等的生物效应进行了研究^[8-11]。

纳米TiO₂具有比表面积大，化学稳定性好等优点一直受到人们的关注。目前，纳米TiO₂的应用十分广泛，例如：在环境科学中，将纳米TiO₂作为光催化剂用于废水处理和饮用水处理^[12]；在医疗领域中，利用TiO₂自身的半导体光催化特性，进行杀菌消毒和癌症治疗^[13]；在科学研究中，将TiO₂作为传感材料应用于传感器的制备^[14]。近期研究表明，TiO₂纳米材料的生物效应与尺寸效应有关^[11]。为此，本文作者以纳米TiO₂为基体吸附尿素酶，研究不同尺寸纳米TiO₂对尿素酶活性的影响；此外，采用纳米TiO₂作为pH敏感膜制备尿素酶/纳米TiO₂复合膜电极，用于测定尿素的浓度。

1　实　验

1.1　仪器与试剂

主要仪器有：PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂制造)；超级恒温水浴(上海宝联仪器厂制造)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司制造)；78HW-3恒温磁力搅拌器(杭州仪器电机有限公司制造)；800B离心机(上海安亭科学仪器厂制造)。

主要试剂有：尿素酶(EC.3.5.1.5 typeⅢ，Sigma公司生产)；TiO₂(粒径分别为5 nm，25 nm和2.4 ?m，广州门德纳米科技有限公司生产)；钛丝(直径为　　　1 mm)；无水乙醇；甲醇；1 mmol/L Na₂HPO₄-1 mmol/L NaH₂PO₄缓冲溶液(PBS)。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2  吸附在纳米TiO₂表面的尿素酶活性的测定

避光下，分别将2 mg粒径为5 nm，25 nm和    2.4 ?m的TiO₂粒子溶于3 mL含0.125 mg/mL的尿素酶溶液中，在4 ℃吸附作用12 h，测定时，于35 ℃，以0.1 mol/L的尿素溶液为酶底物，首先将待测液pH值与酶底物pH值调至相同，测定酶反应的pH值响应变化，记录电位-时间(E-t)曲线。

1.3  尿素酶/纳米TiO₂复合电极测定尿素

首先用细砂纸将钛丝表面打磨干净，然后，分别用1 mol/L NaOH溶液和蒸馏水清洗3次，晾干。将纳米TiO₂凝胶超声15 min，将处理好的钛丝电极在纳米TiO₂凝胶中浸渍1 min后，取出，晾干，重复浸渍数次，获得不同厚度的TiO₂膜电极。

将2 mg尿素酶溶于0.4 mL磷酸盐缓冲溶液中　(1 mmol/L, pH=7.0)，使用前保存于4 ℃冰箱中。TiO₂膜电极浸泡于去离子水中用紫外灯照射15 min，清洗后将其浸渍于尿素酶溶液中24 h(4 ℃)。电极不用时，将其保存于4 ℃的磷酸盐缓冲溶液中。

室温下，用不同浓度的尿素作为酶底物，根据电位法用尿素酶/纳米TiO₂复合电极测定尿素的浓度。

2  结果与分析

2.1  TiO₂纳米粒对酶活性的影响

图1所示为不同粒径的TiO₂对尿素酶活性的影响。可见，没有TiO₂时，游离酶的pH值响应变化很小，分别加入3种不同粒径的TiO₂后，固定化尿素酶的pH值响应迅速提高，并且粒径为25 nm和5 nm的 TiO₂吸附的酶其pH值响应增大显著。这是由于纳米颗粒比表面积大，表面自由能高，吸附能力较高，使更多的酶分子吸附在纳米TiO₂表面。另外，由于纳米颗粒尺寸很小，可以与酶内部的亲水基团发生作用，从而引起酶构型上的变化，这种变化使得酶得活性中心更易接近底物，提高了酶的催化效率。

1—尿素酶吸附在粒径为25 nm的TiO₂表面；2—尿素酶吸附在粒径为2.4 μm的TiO₂表面；3—粒径为2.4 μm的TiO₂溶胶；4—粒径为25 nm的TiO₂溶胶；5—尿素酶吸附在粒径为5 nm的TiO₂表面；6—粒径为5 nm的TiO₂溶胶

图1  不同粒径纳米TiO₂对尿素酶活性的影响

Fig.1  Effect of difference size nano-TiO₂ on activity of urease

对纳米TiO₂的浓度对尿素酶活性的影响进行研究，结果表明，在35 ℃，pH值一定的条件下，以0.1 mol/L尿素溶液为底液，在含0.125 g/L的尿素酶溶液中将纳米TiO₂(粒径25 nm)的浓度从6×10^{-2 g/L}改变至0.5 g/L，酶反应的pH值响应迅速增加，继续增加纳米TiO₂的浓度，pH值响应逐渐下降。

2.2  米氏常数的测定

分别测定游离酶与吸附在不同粒径TiO₂表面的尿素酶的米氏常数。实验表明，尿素酶反应表现出Michaelis-Menton动力学机理特征，其表观米氏常数(K_m)是酶—底物动力学的特征，其值可由Lineweaver- Burk方程求得^[15]：

根据双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，由其斜率K­_m/V，纵轴截距1/V，可求得K_m。

计算求得游离尿素酶的米氏常数为0.45 mol/L，粒径分别为5 nm，25 nm和2.4 μm的TiO₂吸附的尿素酶米氏常数分别为0.22，0.28和0.31 mol/L。由计算结果可以看出：由纳米TiO₂吸附的尿素酶米氏常数较低，酶的活性大，说明纳米TiO₂对尿素酶活性有增强效应。

1—尿素酶吸附在粒径为2.4 μm的TiO₂表面；

2—尿素酶吸附在粒径为25 nm的TiO₂表面；3—游离尿素酶；4—尿素酶吸附在粒径为5 nm的TiO₂表面

图2  底物浓度与尿素酶反应速度的关系

Fig.2  Relationship between urea concentration and urease reaction velocity

2.3  尿素酶/纳米TiO₂复合膜电极测定尿素

尿素酶是生物系统中一种重要的酶，它将尿素催化为CO₂和NH₃，反应式如下：

以纳米多孔TiO₂做固态氧化物膜制备尿素酶/纳米TiO₂复合膜电极，并将其用于尿素的浓度测定。图3所示为尿素酶/TiO₂复合膜电极测定尿素浓度的响应曲线。当8 mL 5 mmol/L尿素加入到15 mL 1 mmol/L PBS溶液后，电极电位随时间逐渐下降最后趋于稳定。实验中还研究了不同膜厚度对电极电位响应的影响，结果表明，膜厚度对于复合电极对尿素的响应没有影响。这是因为，本实验采用直接吸附法固定尿素酶，酶主要固定在TiO₂膜电极的最外层，膜的厚度对尿素酶的固载量没有很大的影响。另一方面，由于纳米多孔膜具有良好的透性，尿素酶可在短时间内与TiO₂多孔膜结合。实验中50~300 s内的?E为检测信号。

图3  尿素溶液加入后电极电位响应

Fig.3  Potential response of urease/TiO₂ electrode after addition of urea

    改变pH值能影响酶活性中心上基团的离解度，同时也影响底物的离解度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化。实验中优化了Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液的pH值，发现该电极在pH值为7~8时，尿素酶pH值响应最大。

    在25~45 ℃范围内测定了温度对电极响应的影响，结果发现，随着温度的升高，电极响应逐渐增大，但当温度大于35 ℃时，酶发生热变性，电极响应反而随温度升高而降低。因此，电极工作条件为：pH值为7~8的PBS缓冲溶液，温度为35 ℃。此时响应最大。

在最佳工作条件下测定尿素浓度对电极电位的影响，结果如图4所示。可见，电极电位与尿素浓度呈线性关系，由线性回归方程求得相关系数为0.993 73，尿素的检测范围为8.5×10^-5~0.15 mol/L，以信噪比为3时(pH计的误差为±1 mV)，求得该方法对于尿素的检出限为5×10^-6 mol/L。

图4  电极响应与尿素浓度c关系

Fig.4  Dependence of potential response of urease/TiO₂ electrode on concentration of urea

在35 ℃，pH=7.0的PBS缓冲溶液中，测定尿素酶/纳米TiO₂复合膜电极的使用寿命(见图5)，结果表明，该电极电位响应可持续35 d，35 d后电极响应仍然维持尿素酶固有活性的38%；电极不用时，浸泡于PBS中，并避光保存于4 ℃冰箱中。

图5  尿素酶/TiO₂复合膜电极的使用寿命

Fig.5  Lifetime of urease/TiO₂ complex films electrode

3  结  论

a. 纳米TiO₂颗粒能够有效地提高尿素酶的催化活性。以纳米TiO₂为固载基体制备的尿素酶/纳米TiO₂复合膜电极与以往的尿素酶电极相比，在测定尿素浓度时有一定的改进。

b. 该尿素酶/纳米TiO₂复合电极制作方法简单，灵敏度高，使用寿命长，无需化学修饰。

参考文献：

[1] Agheli H, Malmstrom J, Hanarp P, et al. Nanostructured biointerfaces[J]. Materials Science and Engineering C, 2006, 26: 911-917.

[2] Keller N, Pietruszka B, Keller V. A new one-dimensional tungsten carbide nanostructured material[J]. Materials Letters, 2006, 60: 1774-1777.

[3] Yakovlev N, Kaveev A, Sokolov N, et al. Novel magnetic nanostructures: Epitaxial cobalt films in transparent fluoride matrix[J]. Current Applied Physics, 2006, 6: 575-578.

[4] Service R F. Nanomaterials show signs of toxicity[J] . Science, 2003, 300: 243.

[5] Brumfiel G. A little knowledge[J]. Nature, 2003, 424: 246-248.

[6] Teixeira A I, Mckie G A, Foley J D, et al. The effect of environmental factors on the response of human corneal epithelial cells to nanoscale substrate topography[J].Biomaterials, 2006, 27(21): 3945-3954.

[7] Kim J, Grate J W, Wang P. Nanostructures for enzyme stabilization[J]. Chemical Engineering Science, 2006, 61: 1017-1026.

[8] Yeates T O, Padilla J E. Designing supramolecular protein assemblies[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2002, 12(4): 464-470.

[9] Woolley A T, Cheung C L, Hafner J H , et al .Structural biology with carbon nanotube AFM probes[J]. Chemistry & Biology, 2000, 7(11): R193-R204.

[10] Hafner J H, Cheung C L, Woolley A T, et al. Structural and functional imaging with carbon nanotube AFM probes[J]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2001, 77(1): 73-110.

[11] Oberdorster G, Finkelstein J N, Johnston C. Acute pulmonary effects of ultrafine particles in rats and mice[J]. Res Rep Health Eff Inst, 2000, 96: 5-74.

[12] 张 烨. 纳米二氧化钛光催化技术在环境科学中的应用[J]. 大理学院学报, 2006, 5(4): 57-60
ZHANG Ye. Application of nanometer TiO₂ photocatalysis technique in environmental science[J]. Journal of Dali University, 2006, 5(4): 57-60.

[13] 张青龙, 沈 毅, 吴国友, 等. 纳米TiO₂的掺杂改性及应用进展研究[J]. 稀有金属快报, 2005, 24(12): 6-10.
ZHANG Qing-long, SHEN Yi, WU Guo-you, et al. Modification of TiO₂ photocatalyst and application[J]. Rare Metals Letters, 2005, 24(12): 6-10.

[14] 翟 琳, 仲 飞, 刘彭义. TiO₂气敏传感器研究进展[J]. 传感器世界, 2005, 10(12): 6-9.
ZHAI Lin, ZHONG Fei, LIU Peng-yi. Advances in research of TiO₂ gas sensors[J]. Sensor World, 2005, 10(12): 6-9.

[15] 张 娟, 徐静娟, 陈烘渊. 基于SiO₂纳米粒子固定辣根过氧化物酶的生物传感器[J]. 高等学校化学学报, 2004, 25(4): 614-617.
ZHANG Juan, XU Jing-juan, CHEN Hong-yuan. A biosensor based on immobilizing horseradish peroxidase on SiO₂ nanoparticles[J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2004, 25(4): 614-617.

收稿日期：2006-09-05

基金项目：国家自然科学基金资助项目(20475065)

作者简介：司士辉(1967-)，男，河南固始人，教授，博士，从事纳米材料及生物传感器的研究

通讯作者：司士辉，男，教授；电话：0731-8836993；E-mail: sishihui@mail.csu.edu.cn