文章编号：1004-0609(2015)08-2309-07
零价铁对奥奈达希瓦氏菌还原U(Ⅵ)的影响及机制
刘金香1，谢水波1, 2，马华龙1，王永华1，陈华柏1，李 标1
(1. 南华大学 污染控制与资源化技术湖南省高校重点实验室，衡阳 421001；
2. 南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室，衡阳 421001)
摘 要：采用现代分析方法探讨零价铁(ZVI)与奥奈达希瓦氏菌(S. oneidensis)MR-1还原U(Ⅵ)的效果与机制。结果表明：ZVI与S. oneidensis均能够还原U(Ⅵ)；在厌氧条件下，ZVI与S. oneidensis还原U(Ⅵ)存在协同作用。当pH为7、温度为30 ℃、U(Ⅵ)的初始浓度为20 mg/L、ZVI的投加量为1.0 g/L时，24 h S. oneidensis对U(Ⅵ)还原率达到96.9%；在0.5~2.0 g/L范围内，U(Ⅵ)的还原率随ZVI投量的增加而上升；在U(Ⅵ)初始浓度5.0~50.0 mg/L内，U(Ⅵ)的还原率与其浓度正相关。ZVI、Fe3O4和Fe2O3均能明显促进U(Ⅵ)的还原，而可溶态的Fe(Ⅲ)对U(Ⅵ)的还原具有明显的抑制作用。其他离子Cu2+、Ca2+、Mn2+和NO3-对U(Ⅵ)的还原存在抑制作用，以Cu2+的影响最大，Ca2+的影响次之，SO42-对U(Ⅵ)的还原影响较小。XPS分析结果表明，ZVI表面吸附和沉积了U(Ⅵ)和U(Ⅳ)两种价态的U元素，反应后的铀大部分形成了稳定的UO2。
关键词：零价铁；U(Ⅵ)；奥奈达希瓦氏菌；XPS分析
中图分类号：X771 文献标志码：A
Effect and mechanism of zero-valent iron on reducing U(Ⅵ) by S. oneidensis
LIU Jin-xiang1, XIE Shui-bo1, 2, MA Hua-long1, WANG Yong-hua1, CHEN Hua-bai1, LI Biao1
(1. Hunan Provincial Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse Technology,
University of South China, Hengyang 421001, China;
2. Key Discipline Laboratory for National Defence for Biotechnology in Uranium Mining and Hydrometallurgy,
University of South China, Hengyang 421001, China)
Abstract: The effects and mechanism of U(Ⅵ) reduction by Shewanella oneidensis (S.oneidensis) MR-1 with zero-valent iron(ZVI) were evaluated. The results show that either ZVI or bacteria can reduce U(Ⅵ) in the solution, and under anaerobic conditions, a cooperative action of ZVI and the bacteria S.oneidensis is observed in reducing process of U(Ⅵ). Under condition of pH 7.0, temperature 30 ℃, the initial concentration of U (Ⅵ) 20 mg/L and ZVI addition 1.0 g/L, the reduction rate of U(Ⅵ) reaches 96.9% by S.oneidensis reduction for 24 h. The reduction rate of U(Ⅵ) is improved with increasing amount of ZVI in the range of 0.5-2.0 g/L, and the reduction rate of U(Ⅵ) is positive correlated with its initial concentration in the range of 5.0-50.0 mg/L. Fe3O4, Fe2O3 and ZVI are effective accelerators for bioreduction of U(Ⅵ), and soluble Fe(Ⅲ) can remarkably inhibit U(Ⅵ) bioreduction. The other coexistence ions, such as Cu2+, Ca2+, Mn2+ and NO3-, show a remarkable negative effect on U(Ⅵ) reduction, and among these ions, the negative effect of Cu2+ is the greatest and that of Ca2+ is the second. SO42- has less influence on U(Ⅵ) bioreduction. XPS results indicate the deposition of U element are in forms of U(Ⅵ) and U(Ⅳ) on iron filings surface, and the reduction product U(Ⅳ) is most likely to be in the form of UO2.
Key words: zero-valent iron ( ZVI); U(Ⅵ); Shewanella oneidensis MR-1; XPS analysis
地下水的铀污染控制是我国铀矿冶领域亟待解决的核环境问题。地下水中的铀常以U(Ⅵ)和U(Ⅳ)两种价态存在，U(Ⅵ)主要以可溶性[UO2]2+形式存在，极易随地下水流动而迁移，构成更大范围的放射性污染和重金属毒害；U(Ⅳ)主要以难溶的沥青铀矿(UO2)形式存在，性质稳定，不易迁移[1]。因此，将六价铀转化为四价铀是地下水铀污染控制的关键。
与传统的物化处理法相比，成本低、耗能少、效率高和无二次污染等优点的生物法成为当前的研究热点[2]。厌氧条件下，希瓦氏菌(Shewanella)可将水体中可溶态的U(Ⅵ)还原成难溶态的U(Ⅳ)，并以晶质铀矿的形式沉淀[3-4]。近期研究证实，Shewanella也能还原其他金属(Pd[5]、Pu[6]、Cr(Ⅵ)[7]、Mn(Ⅳ)[8]、Fe(Ⅲ)[9])以及有毒有机物[10]。Shewanella厌氧条件下具有还原多种高价态金属的特性而备受关注[11]。
零件铁(ZVI)反应速度快、廉价易得，可通过还原、微电解及混凝吸附等机理有效去除水中的U(Ⅵ)，利用ZVI去除地下水中铀等污染物是近年发展起来的一种新技术。但ZVI 在还原U(Ⅵ)过程中，其腐蚀释放的Fe2+容易生成FeOOH沉淀，使其表面钝化，大幅降低修复效果。近期研究表明[12]，厌氧环境下，ZVI可作为电子供体协同微生物对可还原态物质的还原，如Cr(Ⅵ)[13]、Zn(Ⅱ)[14]、硝酸盐[15]、偶氮染料[16]等。也能促进U(Ⅵ)[17]的生物还原，因此，采用ZVI与厌氧微生物协同作用，有望实现U(Ⅵ)的快速还原。目前，关于S. oneidensis还原去除U(Ⅵ)的研究已经开展，但在腐殖质存在条件下，其与ZVI协同作用还原去除U(Ⅵ)的研究鲜有报道。
本文作者以S. oneidensis为实验菌株，探讨AQS存在条件下，ZVI和厌氧微生物协同还原U(Ⅵ)的能力、主要影响因素及机制，以期为地下水铀污染修复提供技术支撑。
1 实验
1.1 实验菌株与培养基
实验菌种奥奈达希瓦氏菌MR-1购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine culture collection of China, MCCC)，MCCC编号1A01706。
培养基组成如下：NaHCO3 2.5 g/L，NH4Cl 0.25 g/L，KCl 0.1 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g /L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，KH2PO4 0.04 g/L，Yeast Extract 1 g/L。还原实验中添加适量的乳酸钠作为电子供体。
1.2 主要试剂和仪器
主要试剂：基准八氧化三铀U3O8(分析纯)，标准铀溶液采用GBW04201方法配制；蒽醌-2-磺酸钠(AQS)，分析纯，Sigma公司生产；铁粉(ZVI)，分析纯，天津志远化学试剂公司生产；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf)，生化培养箱(山东省医疗器械有限公司LRH-250-Ⅱ)，光电子能谱仪(XPS)(美国Thermo ESCALAB 250Xi)。
1.3 实验方法
厌氧培养装置如图1所示。将灭菌后的培养基、10 mmol/L乳酸钠、20.0 mg/L U(Ⅵ)和1 mmol/L AQS组成的微生物培养液加入150 mL锥形瓶中，用NaOH和HCl调节pH值至7.0，并定容至100 mL。用丁基橡胶塞密封瓶口，在装有培养液的实验瓶中充入经过细菌过滤器(0.2 μm)的高纯N2和二氧化碳的混合气，充气时间≥15 min，并在气体的保护下，将定量对数期菌悬液(细菌悬浮液在600 nm波长处的吸光值(D600)约为0.80)接种于培养液中，同时加入1 g/L ZVI，密封所有橡胶管。将实验瓶置于30 ℃、120 r/min的恒温摇床中培养。定时取样分析，每次取样后重新通入气体,以保持瓶内厌氧环境。所取样液经8000 r/min离心10 min，所得上清液经0.45 μm滤膜过滤，留待分析。
实验主要考察U(Ⅵ)初始浓度(5、10、20、30、50 g/L)、ZVI添加量(0、0.2、0.5、1、2 g/L)、铁形态(FeCl3、ZVI、Fe3O4、Fe2O3)、pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)以及其他主要共存离子(Cu2+、Mn2+、Ca2+、NO3-、SO42-)等对U(Ⅵ)还原效果的影响。所有实验组均设置3个平行实验，且取其数据的平均值作为实验结果。
图1 厌氧培养装置
Fig. 1 Anaerobic culture device
每组实验不同条件值均使用同一批微生物同时进行实验，以确保实验比较的可靠性。
1.4 分析测试方法
U(Ⅵ)的测定：采用国家标准GB 6768—86分光光度法测定微量铀。
U(Ⅵ)的去除率E=(c0-c1)/c0×100%(式中：c0、c1分别为反应前后溶液中U(Ⅵ)的浓度)。
对反应后的铁粉进行X射线光电子能谱(XPS)分析，以单色Al Kα (hv =1486.6 eV，功率150 W，500 μm束斑)作为放射源，结合能以C1s 284.8校准。
2 结果与分析
2.1 不同体系还原U(Ⅵ)的效果对比
土壤、水体沉积物等厌氧环境中普遍存在着的腐殖质能有效促进希瓦氏菌属对U(Ⅵ)的还原[18]。因此，实验中以腐殖质模式物AQS作为腐殖质的替代物，设置5种体系进行对照实验。即单独投加ZVI、单独投加菌体、菌体+AQS、ZVI+菌体、ZVI+菌体+AQS。在AQS投加量为1 mmol/L、ZVI投加量为1 g/L、pH为7的条件下各实验组对U(Ⅵ)的还原率如图2所示。从图2可看出，ZVI、菌体及它们的组合均可去除溶液中的U(Ⅵ)，在菌体还原U(Ⅵ)的过程中，24 h内，同时投加菌体和ZVI的实验组其U(Ⅵ)还原率为61.67%，比单独投加菌体的实验组的U(Ⅵ)还原率提高了近8倍，比单独投加ZVI的实验组的U(Ⅵ)还原率提高了近6倍。且ZVI+菌体实验组24 h内，其U(Ⅵ)的去除率明显高于单独添加ZVI或菌体实验组的U(Ⅵ)去除率的叠加。表明厌氧条件下，ZVI和S. oneidensis还原U(Ⅵ) 存在协同作用。
单独投加ZVI的实验组在6 h内U(Ⅵ)去除率达到10.3%后，基本趋于稳定，48 h后，仍只有12.3%。原因在于ZVI对U(Ⅵ)的去除是发生在ZVI表面的氧化还原反应，其动力主要来源于Fe(Ⅲ)/ Fe(Ⅱ)[19]，ZVI表层与水相反应被氧化成Fe(Ⅱ)(Fe0+2H2O= Fe2++2OH-+H2)，水相中U(Ⅵ)与ZVI表面接触时，与Fe(Ⅱ)发生反应并被快速还原为U(Ⅳ)，沉积于ZVI表面的U(Ⅳ)阻碍了U(Ⅵ)的进一步还原。在中性或碱性条件下，这种钝化作用更明显。因此，添加ZVI的实验组在反应初始阶段能得到比较稳定的U(Ⅵ)去除率，而后期U(Ⅵ)去除率不再继续增加。
与ZVI+菌体、菌体+AQS实验组相比，同时添加ZVI、菌体和AQS的实验组对U(Ⅵ)的去除最为迅速，24 h内，其U(Ⅵ)去除率达到 96.9%，比ZVI+菌体实验组的U(Ⅵ)去除率提高35.2%，比菌体+AQS实验组的U(Ⅵ)去除率增加了86.3%。由此可见，AQS存在条件下，ZVI能更加快速地促进S. oneidensis对U(Ⅵ)的还原，后续实验中均添加1 mmol/L AQS。
图2 不同体系对U(Ⅵ)还原率的影响
Fig. 2 Reduction effects of different systems on U(Ⅵ) reduction rate
2.2 U(Ⅵ)初始浓度对其还原性能的影响
本实验室前期开展的S. oneidensis对U(Ⅵ)的耐受性实验表明，U(Ⅵ)初始浓度为50mg/L时，菌体的生长受到明显抑制，U(Ⅵ)初始浓度为80 mg/L时，菌体的结构受到破坏甚至死亡。因此，实验中U(Ⅵ)初始浓度范围设置为5~50 mg/L，图3显示U(Ⅵ)初始浓度对其还原的影响。由图3可看出，U(Ⅵ)的还原率与其初始浓度呈正相关。当U(Ⅵ)的初始浓度为5 mg/L时，其还原率在18 h和48 h内，U(Ⅵ)的还原率分别为44.32%和71.81%；当U(Ⅵ)的初始浓度为10 mg/L时，在18 h和48 h内，U(Ⅵ)的还原率分别为73.85%和86.75%；当U(Ⅵ)的初始浓度增为20 mg/L时，U(Ⅵ)的还原率在18 h和48 h内分别为85.86%和94.64%。当U(Ⅵ)的初始浓度为5~20 mg/L，U(Ⅵ)的还原率随其初始浓度的增加而明显增加。继续增加U(Ⅵ)的初始浓度至50 mg/L时，其还原率增加不明显。
图3 U(VI)初始浓度对U(Ⅵ)还原率的影响
Fig. 3 Effect of initial concentration of U(Ⅵ) on U(Ⅵ) reduction rate
实验证实，在20 mg/L U(Ⅵ)初始浓度条件下，ZVI+菌体+AQS还原体系对U(Ⅵ)的还原率已较理想，当U(Ⅵ)初始浓度增至50 mg/L时，体系仍然对U(Ⅵ)有较强的适应能力。这可能是由于添加的ZVI和AQS均能快速还原部分U(Ⅵ)，减缓其对菌体的毒性。另外，培养基中微量的H2PO4-能与U(Ⅵ)结合，也可部分缓解U(Ⅵ)对菌体的毒性。考虑到铀污染水体中铀含量的实际情况，本实验中U(Ⅵ)初始浓度均采用20 mg/L。
2.3 ZVI的投加量对U(Ⅵ)还原的影响
ZVI投加量对U(Ⅵ) 还原过程的影响如图4所示。图4表明，不同的ZVI添加量对S. oneidensis还原U(Ⅵ)产生不同程度的促进作用。当ZVI添加量从0.2 g/L增加至1 g/L时, 12 h内，U(Ⅵ)的还原率从67.45%升至70.34%；24 h内，U(Ⅵ)的还原率从88.88%升至95.02%。当ZVI投加量为0.2~1 g/L时，U(Ⅵ)的还原率随ZVI添加量的增加而明显增加。当ZVI增至2 g/L时，U(Ⅵ)的还原率升高不明显。这与ZVI与厌氧微生物协同还原地下水中硝基苯时获得结果一致[20]。这可能是由于溶液中ZVI添加量不足时，ZVI的增加可提供更多的活性点位和更多的H2电子供体，从而提高了U(Ⅵ)的还原率。另外，U(Ⅵ)的还原反应在ZVI的表面进行，ZVI添加量的增加直接增加了其表面积，有利于U(Ⅵ)的还原。但当ZVI增加到一定程度，其产H2速度超过微生物利用速度时，ZVI添加量的增加对U(Ⅵ)的还原促进作用减小。因此，本研究中ZVI的添加量取1 g/L。
图4 ZVI投加量对U(Ⅵ)还原率的影响
Fig. 4 Effect of ZVI addition on U(Ⅵ) reduction rate
2.4 铁形态对U(Ⅵ)还原的影响
不同形态的铁对U(Ⅵ)还原能力的影响如图5所示。结果显示，铁的形态对U(Ⅵ)的还原有显著的影响。在ZVI添加量为1 g/L，Fe3O4、Fe2O3和FeCl3添加量均为20 mmol/L的条件下，ZVI、Fe3O4和Fe2O3实验组12 h内U(Ⅵ)的还原率分别为70.35%、71.61%和79.09%；24 h内U(Ⅵ)的还原率均达到95%以上，比空白组(未添加任何形态铁)的U(Ⅵ)还原率提高近85%，说明难溶态的铁(ZVI、Fe3O4 和Fe2O3)均能明显促进U(Ⅵ)的还原。对添加FeCL3的实验组，48 h内，仅去除了10%左右的U(Ⅵ)，比空白组的U(Ⅵ)还原率降低了近50%，表明可溶态的Fe(Ⅲ)对U(Ⅵ) 的还原具有明显抑制作用。这与何云晓等[21]研究的Cu2+、Fe3+对微生物生长及去除溶液中Cr(Ⅵ)的影响实验获得的结果一致。
可溶性的Fe(Ⅲ)对U(Ⅵ)的还原表现为强烈的抑制作用，这可能是由于可溶性的Fe(Ⅲ)通过细胞膜上的通道进入细胞内与细胞蛋白质结合使之变性，或者是Fe(Ⅲ)进入细胞后与酶上的—SH基结合而使其失去活性，也可能是Fe(Ⅲ)与代谢中间产物结合而使代谢受阻。而难溶态的Fe(Ⅲ) 对U(Ⅵ)的还原表现为促进作用，这可能是由于S. oneidensis对U(Ⅵ)的还原反应发生在菌体表面，Fe3O4 和Fe2O3在细胞膜上仅具有低渗透性，Fe(Ⅲ)氧化物通过菌体的厌氧代谢被还原，产生的Fe(Ⅱ)进一步将电子传递到U(Ⅵ)，促进其还原[22]。
图5 铁形态对U(Ⅵ)还原率的影响
Fig. 5 Effect of iron species on U(Ⅵ) reduction rate
2.5 pH对U(Ⅵ)还原的影响
pH不仅影响微生物的生长，也影响ZVI对U(Ⅵ)的还原效果。研究表明，ZVI还原去除水体中的U(Ⅵ) 在酸性条件下效果更好； S. oneidensis属耐酸耐铀菌，在极端环境条件下(pH＞2)仍能存活，但其生长受到较大程度的抑制，其最适pH值为7.0。反应初始pH值对ZVI-微生物协同去除U(Ⅵ)效果的影响如图6所示。由图6可知，在初始pH为2~6条件下，12 h内，各实验组的U(Ⅵ)还原率可达到95%以上；而pH为7的实验组，12 h内仅能还原52%左右的U(Ⅵ)，达到95%以上的U(Ⅵ)还原率需要24 h。由此可见，酸性条件下，U(Ⅵ)的还原去除较中性环境下的更迅速。可能由以下原因所致：酸性条件下，ZVI的腐蚀速率远大于中性及碱性条件，厌氧微生物可快速获得充足的电子供体，而且ZVI腐蚀产生的FeOOH沉淀也不会覆盖其表面产生钝化，显著提高ZVI对U(Ⅵ)的还原去除效果。因此，酸性环境下，菌株的生长虽受到较大程度的抑制，然而U(Ⅵ)的还原去除率反而增加。ZVI+菌体+AQS体系在中性条件也可取得良好效果，考虑到铀污染地下水环境的实际情况，本文作者其他研究中的初始pH取7。
图6 初始pH对U(Ⅵ)还原率的影响
Fig. 6 Effect of initial pH on U(Ⅵ) reduction rate
2.6 共存离子对U(Ⅵ)的还原影响
铀污染水体中其他离子的存在会对U(Ⅵ)的还原产生影响，保持其他条件不变，在微生物培养液中分别加入50 mg/L 的Cu2+、Mn2+、Ca2+和1 mol/L的SO42-和NO3-离子，考察其对U(Ⅵ)还原能力的影响，图7所示为外加离子对U(Ⅵ)还原的影响。从图7可看出，添加了金属离子Cu2+、Ca2+、Mn2+的实验组，12 h内，U(Ⅵ)的还原率分别为3.58%、14.15%、60.76%，无外加离子的对照组的U(Ⅵ)还原率达到了75.16%，这说明Cu2+、Ca2+、Mn2+对U(Ⅵ)的还原均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的影响最为显著，Ca2+的次之，Mn2+的最小。Cu2+的抑制作用可能是由于S. oneidensis的细胞膜上具有还原酶活性的蛋白质, 外加的Cu2+与呼吸链始端脱氢酶蛋白的活性中心相结合，破坏了蛋白的活性中心，从而使该蛋白失去氧化电子供体的能力[23]，对U(Ⅵ)的还原产生了不利影响。研究表明[24]：ZVI可还原Cu2+，从而削弱了ZVI对U(Ⅵ)还原的促进作用。Ca2+的抑制作用可能是其与U(Ⅵ)生成性质稳定的钙铀碳酸盐络合物，U(Ⅵ)作为电子受体时，其活性健不易重新释放，降低了U(Ⅵ)的还原活性，从而影响U(Ⅵ)的生物还原。
与对照组相比，第12 h时，添加了NO3-的实验组U(Ⅵ)的还原率降低了近58%，添加了SO42-的实验组仅降低了约4%。说明SO42-对U(Ⅵ)的还原影响较小，而NO3-对U(Ⅵ)的还原具有明显抑制。NO3-的抑制作用是由于NO3-中氧化态的N5+在厌氧反应体系中具有较强氧化性，与U(Ⅵ)存在自由电子竞争，以致对U(Ⅵ)的还原产生了抑制。
图7 共存离子对U(Ⅵ)还原率的影响
Fig. 7 Effect of coexisting ions on U(Ⅵ) reduction rate
3 U(Ⅵ)还原产物形态分析
为了进一步验证U(Ⅵ)还原产物在ZVI表面的沉积，对ZVI表面铀的形态特征进行XPS分析，结果如图8所示。
从图8可知，U4f7/2轨道和U4f5/2轨道分别在结合能为380~382和392~393 eV处有明显的出峰。根据XPS手册分析可知，U4f7/2轨道处的出峰由UO2(U(Ⅳ)在(380.3±0.4) eV处的峰和UO3(U(Ⅵ)在(381.6±0.3) eV处的峰叠加而成，其含量比约为9:4；U4f5/2轨道处的出峰由U3O8在392 eV处的峰和UO3(U(Ⅵ))在(392.65±0.15) eV处的峰叠加而成，其含量比约为6:1。由此可见，菌体表面吸附和沉积了U(Ⅵ)和U(Ⅳ)两种价态的U元素，U(Ⅵ)处理后，大部分形成了稳定UO2，同时也还残留部分UO3(U(Ⅵ))，该部分可能是菌体吸附所致。
图8 ZVI表面XPS谱
Fig. 8 XPS spectra of ZVI surface
4 结论
1) 在厌氧环境下，ZVI与 S. oneidensis还原U(Ⅵ)存在明显的协同作用，在ZVI投加量为1 g/L、U(Ⅵ)的初始浓度为20 mg/L条件下，24 h内可还原去除96.9%的U(Ⅵ)。ZVI投加量的增加有利于U(VI)的去除，U(VI)的还原率与其初始浓度正相关。
2) ZVI、Fe3O4和Fe2O3对菌体还原U(Ⅵ)的促进作用显著，而Fe3+对U(Ⅵ)的还原有明显的抑制作用。
3) Cu2+、Mn2+、Ca2+、NO3-等离子对U(Ⅵ)的还原均有一定程度的抑制作用，SO42-对U(Ⅵ)的还原影响不明显。
4) 菌体表面吸附和沉积了U(Ⅵ)和U(Ⅳ)两种价态的铀元素，反应后的铀大部分形成稳定的UO2。
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(编辑 李艳红)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(11175081，11475080)；湖南省自然科学基金资助项目(13JJ3078)；湖南省高校创新平台开放基金项目(14K083)
收稿日期：2014-11-21；修订日期：2015-02-12
通信作者：谢水波，教授，博士：电话：0734-8282141；E-mail: xiesbmr@263.net
