混合菌群诱变及诱变菌群对闪锌矿浸出的影响

康  健^{1, 2}，高  健^{1, 2}，吴学玲¹，丁建南¹，邱冠周¹

 (1. 中南大学 资源加工和生物工程学院，湖南 长沙，410083;

2. 湖南科技大学 生命科学学院，湖南 湘潭，411201)

摘  要：将采自不同地区的混合菌分别培养于以黄铜矿和黄铁矿为能源的9 K培养基中，并以该培养物作为出发菌群，用亚硝酸钠(NaNO₂)、硫酸二乙酯(DES)、紫外线(UV)及其组合为诱变剂，对混合菌群进行诱变。诱变后,经过连续浸矿筛选，得到对闪锌矿浸矿效果最好的诱变菌群E。浸矿试验结果表明：在9 K和Leathen培养基中，用诱变菌群E浸出闪锌矿40 d后，Zn²⁺的浸出率分别比对照组提高68%和84%；离心收集Leathen培养基中的菌体和矿样浸渣，弃除液体，加入新的Leathen培养基，在30 ℃和200 r/min条件下，恒温摇床培养20 d后，诱变菌群E对闪锌矿中Zn²⁺的二次浸出率比对照组高92%。

关键词：诱变；混合菌；闪锌矿；生物浸出

中图分类号：Q936         文献标识码：A         文章编号：1672-7207(2007)03-0439-06

Mutagenesis of mixed bacteria and influence on bioleaching of sphalerite with the mutagenized bacterial admixture

KANG Jian^{1, 2}, GAO Jian^{1, 2}, WU Xue-lin¹, DING Jian-nan¹, QIU Guan-zhou¹

 (1. School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China;

2. School of Life Sciences, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, China)

Abstract: The mixed bacteria selected from the sites of different acid mines were respectively enriched in 9K and leathen medium plus chalcopyrite or pyrite as energy substances, then mutagenized with sodium nitrite, diethyl sulfate, ultraviolet(UV) and their combinations respectively. Leaching results show the mutagenized group E (mutagenized bacterial admixture) has much higher ore-leaching rate. Zn²⁺ leached from sphalerite is 68% and 84% higher respectively in the 9K and Leathen media inoculated with mutagenized group E than that in the controlled media inoculated with original (no-mutagenized) mixed bacteria. The content of leached Zn²⁺ increases by 92% compared with that of controlled group.

Key words: mutagenesis; mixed bacteria; sphalerite; bioleaching

生物冶金是一种现代的冶金方法,具有成本低、工艺简单、能够提炼低品位矿的特点。微生物冶金与传统方法冶金相比，微生物菌种活性低、浸出时间长是限制细菌冶金广泛应用的关键因素^[1]。目前，人们对浸矿微生物的研究主要集中在各种微生物分离及其生理生化特性、遗传特性、微生物的蛋白表达和微生物菌种保藏方面^[2-3]。常用的微生物育种方法有2种：一是传统的驯化法，它应用最广泛、最有效，但是自然突变的几率低，选育高效的浸矿菌组合几率低；二是采用单一微生物改良法即单个菌株的诱变、细胞融合、基因工程等。细菌对铁离子、元素硫及其他金属离子的作用不同，具有优势互补作用，因此，单一菌种的遗传改良在应用上存在局限性^[4-7]。

目前，国内在生物冶金中利用复合诱变处理微生物混合菌群的报道很少，康健等^[8]的实验结果表明：混合菌群诱变后，它们在闪锌矿中的生长速度较对照组有很大提高。该实验采用复合诱变混合菌的方法，一方面可以加快微生物浸出速率，另一方面可以高浓度浸出金属离子，最后选育出高效的微生物浸矿菌群。在此，本文作者采用多种诱变剂及不同组合对预先驯化的浸矿混合菌群进行诱变，以期获得高活性的优良浸矿混合菌群应用于锌矿的生物冶金。

1  材料与方法

1.1  实验材料

采用贵州省赫章县某浮选厂的锌精矿进行试验。因为微生物浸矿一般是在酸性环境下进行，而通过浮选的闪锌矿其pH值较高，所以，锌精矿通过2次pH=2的硫酸溶液浸泡处理，每次浸泡1 d。锌精矿清洗干燥后测量其矿物成分。

通过化学元素成分分析，发现该矿石锌的品位较高(见表1和表2)。将矿石粉碎至75 μm，供浸矿实验使用。

表1  闪锌矿化学成分

Table 1  Chemical ingredients of sphalerite  

表2  闪锌矿物相分析

Table 2  Mineralography analysis of sphalerite 

1.2  细菌培养和混合菌诱变

从云南、江西、贵州、广西等地区不同矿区收集的微生物通过富集培养，然后，在金矿、铜矿、铅锌矿中分别进行3个月的驯化处理(用9 K培养基柱浸泡)，然后，混合使用3种矿单独驯化的菌群，用9 K^[9]培养基连续培养3次(30 ℃，200 r/min)，将第4次培养的菌悬液离心(8 000 r/min，30 min)后用无菌生理盐水洗涤3次，制成浓度为1.0×10⁸/mL的菌悬液，供诱变处理时使用。

a. 紫外线(UV)诱变方式^[10]：菌悬液与紫外灯相隔30 cm左右(避光培养)。

b. 硫酸二乙酯(DES)诱变方式^[11]：用1% DES处理菌悬液，用25%硫代硫酸钠中止反应。

c. 亚硝酸钠(NaNO₂)诱变方式^[12-13]：将细菌置于pH为4.6的乙酸缓冲液中，用0.1 mol/L NaNO₂处理，以0.07 mol/L Na₂HPO₄(pH=8.6)中止反应。

d. 组合诱变方式：UV+DES，UV+ NaNO₂，UV+DES+ NaNO₂，DES+NaNO₂。

诱变后对菌群立即进行初筛实验。诱变组合及取样时间见表3。

表3  采用不同诱变方法在不同诱变时间下所得的样品

Table 3  Samples obtained with different mutation treatments and at different sampling time

1.3  浸矿实验

1.3.1  第1次浸矿实验(初筛)

将诱变后的混合菌群分别接种(按种量为1%)至100 mL 矿浆浓度为1%的黄铜矿或黄铁矿的Leathen培养基中，振荡培养10 d(30 ℃，200 r/min)。选生长较好的混合菌群(编号为A，B，C，D和E)和未诱变的菌群CK进行Gram染色观察和以下浸矿实验。

第1次培养条件的选择基于以下原因：

a. 第1次培养时间较少，以便为了避免长时间生长，造成优势菌群大量生长，而暂时的劣势菌群(可能它们浸矿能力较强，但是通过诱变暂时生长速度缓慢)被淘汰的结果。为了让全部细菌在第2次培养时公平竞争，选育出最好的菌群，达到诱变的预期效果。

b. 诱变后微生物菌群在培养时，加入1%黄铜矿、黄铁矿是为了给诱变后混合菌一个熟悉的环境(采集样品时，微生物菌群所处环境就是这些环境；驯化时微生物所处环境也是这些环境)，同时淘汰那些在该环境下生长不好的细菌；富集那些在矿物存在条件下生长良好的菌种，加快选择正突变菌群的速度。

c. 微生物有些特性是质粒提供的，加入选择压 力^[14-15]，可以提高微生物保留质粒的比例，尽可能让微生物不丢失质粒，保留它们的有益特征。

1.3.2  第2次浸矿实验(复筛)

在闪锌矿矿浆浓度10%的Leathen培养基中，接种初筛后生长较好的菌群(编号为A，B，C，D和E)和未诱变的菌群CK，种量为1%，培养条件与第1次的相同，振荡培养为20 d。

1.3.3  第3次浸矿实验(精筛)

在闪锌矿矿浆浓度均为20%的9 K和Leathen培养基中，分别接种复筛后生长的菌群(编号为B，D，E)和未诱变的菌群CK，种量为1%，培养条件与第1次的相同，振荡培养为40 d。

1.3.4  第4次浸矿实验(连续浸矿实验)

使用的矿石为第3次浸矿实验使用的闪锌矿矿渣，混合清洗后，在Leathen培养基中，用 20%矿浆，接种复筛后生长的菌群(编号为B，D，E)和未诱变的菌群CK，种量为1%，培养条件与第1次的相同，振荡培养为20 d。

2  结果和分析

2.1  初筛

生物浸矿是多种细菌参与的复杂自然过程，为了获得锌矿浸出效果好的混合菌群，采用几种常用的诱变剂及其不同的组合对出发菌群进行诱变处理。诱变后的混合菌群第1次浸矿(初筛)的结果表明，对照组的浸矿效果比诱变的浸矿效果好(表4)。其原因是：

a. 诱变时的不良条件处理，使诱变后菌群在第1次浸矿培养时的适应期延长，而浸矿周期(10 d)太短，导致第1次浸矿效果的偏差，没有找到正诱变的菌种。

b. 尽管利用中止液终止诱变，但是，第1次培养时培养基中含有少量的诱变剂，它们一直在影响菌体的生长。所以，所选择培养时间较少，只有10 d。通过第2次接种，可进一步稀释诱变剂，使诱变后的菌能够正常生长。

诱变第1次培养后(初筛)，取在黄铜矿、黄铁矿中生长时混浊度相对较高的5组菌：黄铁矿培养基中DES+诱变60 min和DES 诱变60 min所得的2个菌群；黄铜矿培养基中的DES诱变10 min、UV诱变10 min和UV+DES+诱变100 min所得的3个菌群，依次编号为A，B，C，D和E(见表5)。

在这5组混合菌中没有发现Gram阳性菌株。对诱变后的培养物通过显微镜检查与浸矿效果分析，得出：尽管它们的浸矿效果相近，但它们生长的菌株有很大区别。在黄铁矿培养物中，CK有10%的螺旋菌及多种杆菌，而诱变后生长的都是各种杆菌；在黄铜矿培养物中，CK有20%的螺旋菌，并且有不同形状的螺旋；C，D和E菌群中有少量螺旋菌、大量杆菌。这说明混合菌株的浸矿机理不能用一个简单的细菌外型来解释。

2.2  复筛

通过复筛(第2次浸矿实验)，得到浸矿效果较好的菌群B，D和E。B菌群、D菌群和E菌群中Zn²⁺浸出量分别比对照组提高了85%，78%和117%(表6)，说明采用混合菌诱变策略能够提高细菌浸矿能力。

2.3  精筛

为了考察3组混合菌的浸矿性能在不同培养基中是否稳定，采用9 K和Leathen培养基进行第3次浸矿实验(精筛)。结果表明(表5)，3组混合菌的Zn²⁺浸出量均比没有诱变处理的对照组高。其中E菌群的浸矿效果最佳，在含闪锌矿的9 K和Leathen培养基中浸矿40 d后，Zn²⁺的浸出量比CK分别提高68%和84%，同时，B菌群较CK分别提高59%和75%。

表4  诱变后第1次培养结果

　　　　　　　　Table 4  The result of first cultivating after mutation treatments　　　　　　　

表5  诱变后菌群编号

Table 5  The number of mixed bacterial after mutation

表6 　混合菌Zn²⁺的浸出

Table 6  Zn²⁺ leaching of mutated mixed bacteria

通过精筛，得到浸矿效果好的B菌群、E菌群，进行下一步实验。

这些结果表明，不管采用那种培养基，诱变后的3组混合菌的浸矿性能是稳定的。

2.4  连续浸矿

通过精筛，结果表明B和E菌群在高浓度闪锌矿中能够高效浸出Zn²⁺。为了研究混合菌群E和B是否适宜高纯度闪锌矿的连续浸矿，用精筛后的锌矿石进行进一步浸矿实验。结果显示，通过20 d浸矿，菌群E仍然能够浸出2.42 g/L Zn²⁺，而对照仅仅浸出1.26 g/L Zn²⁺ (图1)。

表7  混合菌不同培养基浸矿时间和Zn²⁺浸出结果

Table 7  Time-course of Zn²⁺ leaching by mutated bacteria in different medias 　

1—CK; 2—B; 3—E

图1  连续浸矿试验结果

Fig.1  Results of continuous bioleaching test

常规的诱变只是针对某一单菌株，而生物浸出是多种细菌共同参与的、复杂的生物与化学过程，因此，好的单菌株简单组合不一定适合矿石环境，达不到最优化的菌株组合，得不到最好的浸矿效果。通过浸矿混合菌的诱变，可以筛选到单个菌株浸矿效果可能不是最好的、但其组合后浸矿是优化的混合菌群组合，从而提高浸矿的效果。实验结果表示诱变混合菌群的实验方法对于提高闪锌矿的生物浸出效果是可行的。

3  结  论

a. 经过复筛，菌群B，D和E在闪锌矿矿浆浓度为10%的leathen培养基中培养20 d，浸出的Zn²⁺浓度比CK分别提高86%，78%和117%，说明用传统方法诱变混合菌可提高菌群对锌矿的浸矿效果。

b. 经过精筛，菌群E在闪锌矿矿浆浓度20%的9 K和leathen培养基中培养40 d，浸出Zn²⁺浓度比CK分别提高68%和84%；同样条件下，菌群B浸出Zn²⁺浓度比CK比分别提高59%和75%。结果表明菌群B和菌群E的浸矿性能在9K和leathen培养基的条件下是比较稳定的。

c. 经过连续浸矿实验，菌群E用精筛试验后的矿渣作为能源物质，在闪锌矿矿浆浓度20%的leathen培养基中，通过20 d培养，浸出Zn²⁺浓度比CK提高92%。

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收稿日期：2007-01-10

基金项目：国家自然科学基金创新研究群体项目(50321402); 国家重点基础研究发展计划项目(2004CB619201)

作者简介：康  健(1964-)，男，湖南湘潭人，副教授，博士研究生，从事微生物冶金的研究

通讯作者：邱冠周，男，教授；电话：0731-8879212; E-mail: qgzfblw@163.com