添加载银纳米TiO2对硅橡胶抗菌性能及生物相容性的影响
陈良建，黄冬梅，张思慧，袁剑鸣
(中南大学 湘雅三医院，湖南 长沙，410013)
摘 要：研究添加载银纳米TiO2对硅橡胶的抗菌性能及生物相容性的影响。将载银纳米TiO2粉末按不同质量分数0~2.5%添加至硅橡胶，在140 ℃高温硫化1.5 h制成样品；采用浸渍培养法检测样品的抗菌性能；采用MTT法检测样品的细胞毒性，并采用体外细胞培养实验检测样品对细胞黏附的影响，实验细胞为小鼠成纤维细胞(Rat fibroblast cells, L929)。研究结果表明，在TiO2粉末含量为0~2.0%时，硅橡胶的抗菌率随添加载银纳米TiO2含量的增加而增加；当添加量为2.0%和2.5%时，其抗菌率均达100%；当TiO2含量为0与2.0%时，浸提液对L929无细胞毒性；与L929接触培养48 h后，在TiO2含量为2.0%的样品表面，细胞呈长梭形，伸展良好，而不添加TiO2的样品表面，细胞伸展欠佳，多数细胞蜷缩变形成枣核状；添加载银纳米TiO2后硅橡胶具有抗菌性、无细胞毒性并有利于细胞的黏附。
关键词：纳米；二氧化钛；硅橡胶；生物相容性
中图分类号：R318 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2010)02-0526-06
Effect of addition of Ag-embedded nano-TiO2 on antibacterial activity and biocompatibility of silicone rubber
CHEN Liang-jian, HUANG Dong-mei, ZHANG Si-hui, YUAN Jian-ming
(Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, China)
Abstract: The effects of addition of Ag-embedded nano-TiO2 on antibacterial activity and biocompatibility of silicone rubber in vitro were investigated. Ag-embedded nano-TiO2 was added to medical silicone rubber materials ranging from 0 to 2.5%, and the samples were vulcanized at 140 ℃ for 1.5 h. In vitro bacteria culture, the antibacterial effect of samples was tested. MTT assay method was used to evaluate the cytotoxicity of sample to the rat fibroblast cells L929. Cell culture method was used to assess the influence of sample on adhesion of L929. With the increase of Ag-embedded nano-TiO2 content, the inhibition rates of the samples increase. The inhibition rates of samples with the addition of 2.0% and 2.5% TiO2 are both 100%. The leaching liquors without TiO2 and with the addition of 2.0% TiO2 are nontoxic to L929. After cultured for 48 h, L929 cells are flat and extended to long spindle shapes on the surface of samples added 2.0% TiO2, while most L929 cells on the surface of samples without TiO2 are rolled up. Silicone rubber with Ag-embedded nano-TiO2 has outstanding antibacterial property. Cell adhesion of silicone rubber can be improved by adding Ag-embedded nano-TiO2.
Key words: nanometer; titanium dioxide; silicone rubber; biocompatibility
赝复体修复上颌骨缺损一般是在术后3~6月进行，这段时期对缺损区未做修复治疗，严重影响了患者的面容、言语、吞咽等功能，生活质量下降，不利于患者的早期康复和身心健康[1-2]；因而，解决上颌骨切除术后早期修复很有必要。医用硅橡胶是常用的假体植入材料，生物相容性好，质地柔软且富有弹性，能利用缺损区的组织倒凹获得固位，是上颌骨切除术后早期修复材料的首选。但硅橡胶存在如下不足：表面亲水性差，与机体的亲合力差，材料表面抛光打磨困难，易发生细菌和真菌附着[3-4]，作为早期修复材料，可能增加口腔感染的机会，对伤口愈合不利。有学者采用添加抗菌药物、短时间药物浸泡等方法[3, 5]对硅橡胶进行表面处理，提高硅橡胶的抗菌性，但上述处理只是短时间内有效，且易产生耐药性，临床应用受限。载银纳米TiO2抗菌效果好、安全性高，是一种具有长效性的无机抗菌剂[5]，在医用硅橡胶中添加载银纳米TiO2有望成为改善其抗菌性能的一种方法。本文作者在医用硅橡胶中添加不同量的载银纳米TiO2，探讨添加载银纳米TiO2对硅橡胶的抗菌性能及生物相容性的影响，以便为研制上颌骨缺损早期赝复体修复提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为：粒径为20~80 nm的载银纳米TiO2，其形貌如图1所示；医用高温硫化硅橡胶(江阴市国光硅橡胶制品有限公司生产)；金黄色葡萄球菌标准株(中南大学湘雅三医院检验科提供)；小鼠成纤维细胞L929(中南大学湘雅中心实验室提供)。
图1 载银纳米TiO2 TEM形貌
Fig.1 TEM image of Ag-embedded nano-TiO2
1.2 试样制备
常温下将载银纳米TiO2按质量分数0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%分别加入医用高温硫化硅橡胶混合物中，制成厚约1.5 mm的样品，放入真空干燥箱中高温硫化(温度约140 ℃，1.0~1.5 h)制备成长×宽×高为10 mm×10 mm×1.5 mm的硅橡胶试样，超声清洗，分组密封装袋，灭菌后备用。
1.3 性能检测
1.3.1 添加载银纳米TiO2硅橡胶抗菌性能(浸渍培养法)
用接种环从培养基中取少量金黄色葡萄球菌，加入无菌生理盐水中，制成含菌浓度为1×105 CFU/mL的菌液。采用浸渍培养法测定添加载银纳米TiO2后硅橡胶的抗菌性能，将样品浸泡在5 mL菌液中，空白对照组采用不加任何样品的菌液；阳性对照组菌液中含载银纳米TiO2粉末。在(37±1) ℃培养5~8 h后，各组取20 μL菌液接种于血琼脂培养基上，在(37±1) ℃培养48 h后，进行菌落计数。以上试验设置3组平行组，结果取平均值。将测定的菌落数按下式计算抗细菌率：
式中：r为抗细菌率，%；b为空白对照平均菌落数；c为添加抗菌剂的样品平均菌落数。
1.3.2 添加载银纳米TiO2硅橡胶细胞毒性实验
根据抗菌实验结果，采用含0%和2% TiO2的样品进行细胞毒性(MTT法)实验。
将TiO2含量为0%与2.0%的样品按表面积与浸提介质体积比(S/V)为1 cm2/mL浸泡于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，在培养箱中浸提72 h，收集浸提液并于4 ℃保存。
将L929细胞按5 000个/孔接种于96孔细胞培养板，培养1 d。分别设材料组、阴性对照组和阳性对照组进行实验，材料组采用100%，50%和10%浓度的材料浸提液；阴性对照组为含10%小牛血清的新鲜RPMI1640培养基；阳性对照组为0.064%苯酚溶液。每组设6个复孔进行实验。弃原培养液，分别加入200 μL上述实验组培养液，在37 ℃，5% CO2环境中继续培养3 d。采用MTT法用酶联免疫检测仪在波长为490 nm处测量各孔的光密度OD490，并进行统计学 分析。
1.3.3 添加载银纳米TiO2硅橡胶对成纤维细胞黏附功能的影响
调整细胞浓度为1.5×104个/mL，用加样器取2 mL细胞悬液分别接种于含0%与2.0% TiO2的样品的24孔培养板内，每样本设5复孔，然后于5% CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱内培养48 h，最后，用2.5%戊二醛固定，将硅橡胶样品置于环境扫描电子显微镜下检测成纤维细胞在含0%和2.0% TiO2的样品表面的黏附形态。
2 结果
2.1 添加不同浓度载银纳米TiO2硅橡胶的抗菌性
表1所示为添加不同浓度载银纳米TiO2硅橡胶抗菌率。从表1可看出：添加银纳米TiO2的浓度不同，其抗菌率也不同，在硅橡胶添加质量分数为2.0%或2.5% TiO2时，试样对金黄色葡萄球菌的抗菌率为100%。图2所示为不同浓度载银纳米TiO2硅橡胶试样与菌液复合培养8 h后，取 20 μL菌液接种于血琼脂培养基培养48 h的菌落生长状况。可见：含TiO2 2.0%和2.5%的试样均未见细菌生长。上述结果表明：当硅橡胶添加载银纳米TiO2含量为0~2.0%时，其抗菌率随添加量增加而增加；当TiO2添加量为2.0%及以上时，其抗菌率达100%。
表1 添加载银纳米TiO2硅橡胶的抗菌率
Table 1 Antibacterial ratio of addition of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber
2.2 MTT结果
培养3 d后L929细胞形貌如图3所示。可见：在浓度为100%，50%和10%的材料浸提液作用下，L929形态与阴性对照组相比无明显差别，而阳性对照组细胞数量逐渐减少，细胞体积变小，最后无完整细胞，只能看到细胞裂解后的碎片。
根据MTT法测定的光密度OD计算相对增殖率(R)：
其中：ODt和ODc分别为实验组和阴性对照组光密度。
根据相对增殖率进行细胞毒性分级(CTS)。添加载银纳米TiO2硅橡胶细胞毒性试验结果如表2所示。可见：含2.0% TiO2的样品浸提液与阳性对照组比较均差异显著(P＜0.05)；不同浓度的浸提液间无显著性差异，CTS均为0和1级，说明本研究添加载银纳米TiO2硅橡胶对L929无毒性，符合《医疗器械生物学评价国家标准GB/T 16886.5—2003》中对材料细胞毒性要求。
表2 添加载银纳米TiO2硅橡胶细胞毒性试验结果
Table 2 Results of cytotoxicity assay of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber
(a) 阴性对照组样品; (b) 不含TiO2; (c) 0.5% TiO2; (d) 1.0% TiO2; (e) 1.5% TiO2; (f) 2.0% TiO2; (g) 2.5% TiO2; (h) 阳性对照组样品
图2 菌液与样品培养8 h后再接种于血琼脂培养基培养4 d的菌落生长情况
Fig.2 Colony growth situations of bacteria liquid cultured with samples for 8 h and then implanted blood agar cultured for 4 d
(a) 不含TiO2, 50%浸提液；(b) 2% TiO2, 50%浸提液；(c) 阴性对照组；(d) 阳性对照组
图3 L929与添加载银纳米TiO2硅橡胶浸提液培养3 d后细胞形貌
Fig.3 Situations of L929 cells cultured with leaching liquor of addition of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber for 3 d
(a) 不含TiO2; (b) 2.0% TiO2
图4 硅橡胶与L929细胞培养48 h后表面形貌
Fig.4 SEM images of L929 cells after cultured 48 h with silicon rubber
2.3 添加载银纳米TiO2硅橡胶对L929黏附的影响
不含TiO2和含2.0% TiO2的硅橡胶样品与L929接触培养48 h后，采用扫描电子显微镜检测，结果如图4所示。可见：不含TiO2的样品表面细胞伸展欠佳，部分细胞蜷缩变形成枣核状(图4(a))；在含2.0% TiO2的硅橡胶样品表面细胞黏附于材料表面，大部分细胞呈长梭形，伸展良好，可见伪足，排列交织成网状(图4(b))。
3 讨论
硅橡胶材料生物相容性好，是常用的假体植入材料，是上颌骨切除术后早期修复的首选材料，但硅橡胶表面细菌和真菌易附着，口腔感染机会增加，不利于伤口的愈合。有学者提出在硅橡胶中添加抗真菌药及表面处理来改善硅橡胶的抗菌性能，如：Mark等[5]将克霉唑和置霉菌素加入硅橡胶中，发现有抗菌效果；Osterhof等[6]经研究发现：采用硅橡胶表面涂覆季铵硅烷涂层的方法能提高材料表面的抑菌性能，但作用效果短暂，不宜临床推广应用。纳米无机抗菌剂是利用纳米技术将无机抗菌剂制备成纳米微粒抗菌剂，具有极大的比表面积，提高了与细菌的亲和力[7-10]，具有高安全性、长效性、无耐药性、广谱性等优点。本研究所采用的载银纳米TiO2综合了银离子与纳米TiO2抗菌性能的优点：实现银的缓释，延长杀菌功效，安全、持久、无耐药性，能与高分子材料进行均匀混合。其抗菌机制可能是：银沉积到纳米TiO2表面，一方面，有效防止TiO2光催化时电子－空穴对的复合，从而促进了TiO2的光催化活性[11]；另一方面，银离子既可与菌体中酶蛋白中的巯基结合，代谢关键酶失活，致使细菌不能代谢而死亡[12]，银离子也可与致病菌DNA碱基结合并形成交叉链接，置换嘌呤和嘧啶中相邻氮之间的氢键，使DNA变性而不能复制，导致致病菌失活[13]。
本研究采用浸渍培养法检测添加载银纳米TiO2硅橡胶的抗菌性能，检测发现：随着载银纳米TiO2加入量的增加，抗菌率也增加，当TiO2加入量为2.0%和2.5%时，抗菌率可达100%。可推断抗菌率与添加载银纳米TiO2量有关，特别是与硅橡胶表面暴露的载银纳米TiO2的量有关；当TiO2添加量较低时，硅橡胶表面暴露的载银纳米TiO2的含量有限，故抗菌率较低；随着添加量的增加，硅橡胶表面暴露的载银纳米TiO2的含量随之增加，抗菌率也增高；当添加载银纳米TiO2的含量为2.0%时，硅橡胶材料已有很好的抗菌效果。结果说明：添加载银纳米TiO2抗菌剂的硅橡胶对L929无毒性，在硅橡胶中添加载银纳米TiO2的含量为2.0%比较合适。
影响细胞黏附的因素主要有表面形貌和粗糙度、表面化学、表面亲水性、表面能和表面电荷等，一般认为：粗糙的表面结构、良好的表面化学组成、表面亲水性、合适的表面自由能和表面电荷有利于细胞的黏附[14]。本研究在硅橡胶中添加载银纳米TiO2，体外细胞共培养，扫描电镜检测结果表明：添加载银纳米TiO2的硅橡胶有利于细胞的黏附。这可能与添加载银纳米TiO2的硅橡胶表面暴露的纳米粒子特有的表面界面效应有关，纳米粒子的表面原子数量大于普通粒子表面原子的原子数量，由于缺少邻近的配位原子而具备很高表面能，材料表面有许多不饱和化学键，提供了很多吸附位点与作用位点，极易与外来原子通过化学键结合，提高了与细胞的亲和力，有利于细胞的黏附[15]。添加载银纳米TiO2的硅橡胶有望成为上颌骨切除术后早期修复的材料。
4 结论
(1) 添加载银纳米TiO2的医用硅橡胶具有抗菌性，当添加载银纳米TiO2含量为0~2.0%时，其抗菌率随添加含量增加而增加，当添加量为2.0%及以上时，其抗菌率达100%。
(2) 添加载银纳米TiO2硅橡胶的浸提液无细胞毒性，符合生物材料细胞毒性要求。
(3) 在添加载银纳米TiO2硅橡胶的样品表面黏附的细胞伸展良好，排列交织成网状，而未添加载银纳米TiO2硅橡胶的样品表面黏附的细胞伸展欠佳，伪足少，部分细胞蜷缩变形成枣核状。添加载银纳米TiO2的硅橡胶有利于细胞的黏附。
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收稿日期：2009-09-06；修回日期：2009-11-25
基金项目：湖南省卫生厅课题(C2007-012)
通信作者：陈良建(1967-)，男，湖南攸县人，博士，副教授，从事牙种植体修复、颌骨缺损的赝复体修复及新型钛种植体的研发；电话：0731-88618554；E-mail: chen0313@xy3yy.com
(编辑 赵俊)
