西南印度洋深海重金属抗性菌的分离鉴定与多样性分析
段雪1, 2，邵宗泽1
(1. 国家海洋局第三海洋研究所，国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门，361005;
2. 厦门大学 生命科学学院，福建 厦门，361005)
摘要：利用大洋第21航次采集的西南印度洋中脊热液区的环境样品进行了重金属抗性菌的富集分析鉴定与多样性分析。从5个样品中通过Cu，Zn，Cd和Cr 4种重金属富集，平板分离、REP-PCR和16S rDNA鉴定，最终分离得到51株细菌，属于24个属39个种，多样性非常丰富。其中，变形菌纲γ亚纲占绝对优势(48%)，其余4类占较小的比例，其中，变形菌纲门α亚纲占14%，放线菌门Actinobacteria占18%，厚壁菌门Firmicutes占12%，拟杆菌门Bacteroidetes占8%。在γ亚纲中Halomonas属和Idiomarina属占大多数，且在大部分站点中都有分布。此外，Nitratireductor，Salegentibacter，Pseudidiomarina，Belliella，Marinimicrobium，Cellulosimicrobium和Joostella是作为重金属抗性菌的首次报道。
关键词：深海；热液区；重金属抗性；微生物
中图分类号：Q939 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2011)S2-0160-07
Isolation and diversity analysis of heavy metal resistant bacteria from deep-sea sediments of SWIR
DUAN Xue1, 2, SHAO Zong-ze1
(1. Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources, The Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China;
2. School of Life Science, Xiamen University, Xiamen 361005, China)
Abstract: The bacteria of heavy metal tolerance were isolated and subjected to diversity analysis from the hydrothermal field samples of Southwest Indian Ridge (SWIR) in 21st scientific voyage. Fifty-one strains of heavy metal resistance screened with Cu, Zn, Cd and Cr were obtained from 5 samples of SWIR, which belonged to 39 species of 24 genera identified based on REP-PCR and 16S rDNA, representing a high diversity. Among them, γ-proteobacteria occupies the majority (48%), other 4 subclasses exhibit as minorities including α-proteobacteria (14%), Actinobacteria (18%), Firmicutes (12%) and Bacteroidetes (8%). Bacteria of genus Halomonas and Idiomarina are most frequently isolated. Moreover, bacteria of the following genera including Nitratireductor, Salegentibacter, Pseudidiomarina, Belliella, Marinimicrobium, Cellulosimicrobium and Joostella are the first report as heavy metal resistant bacteria.
Key words: deep sea; hydrothermal field; heavy metal resistance; microorganisms
深海重金属抗性菌的研究多集中于热液口环境。深海热液活动中有多种重金属随热液及热液羽流进入周围环境。前人在热液区已经发现有镉抗性菌和钴抗性菌[1]、亚碲酸盐和亚硒酸盐抗性菌[2]以及汞还原 菌[3]。从非热液深海沉积物中，也可以分离获得抗性菌。例如从太平洋深海沉积物中分离获得锰抗性菌、铅抗性菌等[4-5]。从类群上看，深海重金属抗性菌多属于γ-变形菌纲、高G+C革兰氏阳性菌群(Kocuria，Brachybacterium，Brevibacterium，Arthrobacter，Microbacterium)、低G+C革兰氏阳性菌群(Bacillus，Staphylococcus，Enterococcus，Streptococcus)、也有α-变形菌纲(Paracoccus)、β-变形菌纲(Alcaligenes)、ε-变形菌纲(Campylobacter)、CFB类群(Flavobacterium)。其中，γ-变形菌纲的抗性菌种属最为丰富，常见的属包括Halomonas，Alcanivorax，Shewanella，Moritella， Pseudomonas，Photobacterium，Marinobacter，Psychrobacte， Xanthomonas，Alteromonas， Aeromonas，Pseudoalteromonas，Moraxella，Vibrio，Acinetobacter等。
西南印度洋中脊是超慢速扩张洋中脊。前期研究中，从2007年调查航次所获得的热液区沉积物样品发现了若干砷抗性菌，其中Microbacterium 以及Alcanivorax属的细菌具有较高的3价砷抗性[6]。此次利用2009年新获得热液口及附近海域的深海沉积物样品，进行重金属抗性菌的多样性研究。
1 材料方法
1.1 深海样品来源
研究所用的深海沉积物及热液硫化物样品是由“大洋一号”考察船DY115-20航次于2009 年2月取自西南印度洋的深海沉积物样品，采样由TVG完成，采集的沉积物样品在超净台中分装于采样杯中，于4 ℃保存。样品详细信息见表1。
表1 深海沉积物样品的来源和特征
Table 1 Characteristics and sources of deep sea sediment samples
1.2 培养基
216L液体培养基成分(1 L)为：乙酸钠1 g，硝酸铵0.2 g，柠檬酸钠0.5 g，普通肉汤培养基0.5 g，蛋白胨10g，酵母粉2 g，琼脂粉15 g(固体培养基)。加海水至1 L, 调pH至7.5，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.3 海洋重金属抗性菌的富集、分离
取5个站位的深海底泥样品用4种重金属富集，各取1 g接种于100 mL 216L液体培养基于250 mL三角瓶中，4种重金属分别是1 mmol/L CuSO4，1 mmol/L ZnSO4，1 mmol/L CdSO4和0.5 mmol/L K2Cr2O7，于28 ℃及200 r/min摇床培养10~15 d。培养液出现明显混浊，从培养液中取出1 mL转入100 mL新鲜的含重金属的216L液体培养基中。转接2次，将3次转接的富集液梯度稀释后涂布于含有相同重金属浓度的平板上，28 ℃温箱培养7 d后，从平板上挑出不同形态的菌落，再进行划线纯化，长出单菌落后再划线纯化1次。
对同一个站点分离获得的菌株，利用REP-PCR进行分型，带型相同的认为是重复菌株。REP-PCR的引物是5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′。
1.4 重金属抗性菌的16SRNA鉴定与系统进化分析
提取单菌DNA，用重复PCR合并相同菌株后进行16S rRNA测序。16S rRNA PCR扩增所用的引物是16SF：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′与 16SR：5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3′，目的片段为1 500 bp左右。所用的TaqDNA聚合酶由Takara公司生产。PCR产物纯化用上海生工的U-10柱式胶纯化试剂盒分离纯化；纯化产物用引物P300测定中间800 bp的序列。
16S rRNA系统发育树构建时，先将各单菌的序列进行blastn分析，下载其同源性最高的菌株及模式菌株序列。最后对所有序列用DNAMAN进行比对分析，输出clustal格式的比对结果，再用MEGA4.0以邻位法构建系统进化树。
1.5 重金属元素的分析
取深海沉积物样品2～3 g，将样品冷冻后，用冷冻真空干燥机干燥，研磨后取得干粉，准确称取0.5 g，用导电胶粘贴到样品台中，用电子探针-能谱仪(Electron Probe-Energy Dispersive X-ray Spectroscope，EP-EDX)检测所含金属元素。
2 结果
2.1 样品金属元素种类与含量
5个站位的样品经过电子探针-能谱仪检测后，结果如表2所示。5个站点所检测到的大多是钙、铁、钠、镁、铝、硅，锌等海洋中含量较多的元素，其他金属元素很少出现。原因是样品中含有大量的碳氧元素，其他元素未能达到检测限的比例。其中，S10-8样品中含部分烟囱体，硫化物含量较高；S25-21为多金属硫化区，铁硫的含量也高于其他样品。
表2 5个IR站位样品的电子探针-能谱仪元素检测
Table 2 Elements inspection of 5 IR samples by EP-EDX
2.2 重金属抗性菌的富集、分离与鉴定
5个站位的样品用4种重金属富集后，转接2次，纯化2次后，提取单菌DNA，用重复PCR合并相同菌株后进行16S rRNA测序。5个站点根据上述步骤筛选出了51株细菌(如图1所示)。
通过菌落形态辨认和REP-PCR分析后，合并相同站点分离到的菌株，对这些REP-PCR结果相同，形态接近的菌株在进行16S rDNA测序时，只挑取其中的1个。16S rDNA测序后，相同或相近的细菌在西南印度洋5个不同站点中多次被分离到，这些细菌在海洋环境中广泛分布。
通过形态辨认、REP-PCR和16S rDNA鉴定，最终确认5个站点中最初分离到了51株细菌，属于24个属。该样品多样性非常丰富，多数分离菌株均属于不同的属。其中，S4-4站点的A-1与GenBank中相似度最高的菌株分别是Kangiella koreensis DSM 16069T (NR_027574 )，同源性为95.1%，是该属可能的新种。5个站点分离菌株多样性情况，具体见表3。
2.3 基于16S rRNA基因的系统发育分析
用参比菌株及本文分离自西南印度洋深5个站位样品的51株细菌的16S rRNA基因序列，通过DNAMAN软件进行多序列比对，然后输出NBRF格式多序列比对结果，再用MEGA4.0构建系统发育树，如图2所示。
按大类群的可将这51株可培养菌分为5大类，如图3所示。从图3可以看出，变形菌门占绝对优势(48%)，其余4类占较小的比例，分别是变形菌门α纲(14%)，放线菌门Actinobacteria(18%)，厚壁菌门Firmicutes 占(12%)和拟杆菌门Bacteroidetes 占(8%)。
图1 形态相似菌株的REP-PCR分析
Fig.1 REP-PCR analysis for bacterial isolates of similar morphology
表3 分离自5个IR深海站点样品的重金属抗性菌株
Table 3 Heavy metal-resistant bacteria isolated from 5 IR deep sea samples
图2 深海沉积物可培养菌系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of culturable strains isolated from deep sea sediment
图3 西南印度洋沉积物细菌类群多样性统计
Fig.3 Phylogenetic distribution of different types of isolates from the India Ocean sediments
变形菌门的γ纲的单菌数目最多，种属多样性比较丰富，其中Halomonas 属和Idiomarina属占大多数，这2个属在大部分站点中都有分布，是分布广泛的细菌。另外7个属只在个别菌群(1或2个)中分离到，这7个属分别是Pseudidiomarina，Marinobacter，Alcanivorax，Marinimicrobium，Kangiella，Pseudoalteromonas和Pseudomons。α亚纲包含了4个属，即Nitratireductor，Mesorhizobium，Paracoccus和Erythrobacter，多样性也比较丰富。Actinobacteria (放线菌门，高G+C革兰氏阳性菌)类群占总菌数的18%，包含5个属：Arthrobacter，Kocuria，Brachybacterium， Cellulosimicrobium，Microbacterium。Microbacterium在3个站点都有分离到，筛选自S4-4，S12-10和S25-21，且多样性丰富，分属3个种即Microbacterium phyllosphaerae，Microbacterium esteraromaticum 和Microbacterium dextranolyticum。这个类群的细菌大部分分离自S25-21站点，可能与这个站点的特殊环境有关。其它两个类群则各自仅只包含3个属，如Firmicutes (厚壁菌门，低G+C革兰氏阳性菌)中包括Bacillus属 3株菌，Staphylococcus属2株菌，和Exiguobacterium 属1株菌。Bacteroidetes(拟杆菌门)包含3个属(Salegentibacter、Joostella与Belliella)，共4株菌。所分离到的可培养菌中，除了少数种属如Halomonas 和Idiomarina外，大部分属都只在个别站点中分离到，且多数属只包含1个种1株菌，说明站点间的差异性比较大。以下为各种类群和各属细菌数目的比例。分离菌株在属水平的多样性见图4。
图4 分离自西南印度洋5个站点的24个属的菌株分布
Fig.4 Phylogenetic distribution of isolates from the India Ocean sediments at level of genus
3 结论
西南印度洋中脊深海重金属抗性菌研究比较少。利用富含重金属的培养基对印度洋中脊深海沉积物样品进行富集，分离得到了多种重金属抗性菌，共51株，分属于24个属39个种，表明该区域的重金属抗性微生物具有丰富的多样性。
16S rRNA序列显示，细菌分别属于Arthrobacter，Bacillus，Belliella，Brachybacterium，Brachybacterium和Cellulosimicrobium等24个属。其中，Nitratireductor，Salegentibacter，Pseudidiomarina，Belliella，Marinimicrobium，Cellulosimicrobium和Joostella是作为重金属抗性菌的首次报道。
对于已经取得的丰富的菌种资源，应更一步分析获得的高抗性菌株的抗性机制，寻找并验证重金属抗性基因和分析抗性基因多样性。
参考文献:
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(编辑 邓履翔)
收稿日期：2011-06-15；修回日期：2011-07-15
基金项目：中国大洋协会项目(DYXM115-02-2-05)
通信作者：邵宗泽(1964-)，男，山东昌邑人，研究员，从事海洋微生物资源学、海洋环境微生物学研究；电话：0592-22195321; E-mail: shaozz@163.com
